一种花生线粒体DNA的提取方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种花生线粒体DNA的提取方法，为建立一种适用于提取高质量花生线粒体DNA的方法，本发明专利技术结合不同物种mtDNA提取方法的特点并对其进行优化，通过在线粒体提取液中加入甘油，并且在沉淀mtDNA时加入糖原，从而有利于花生mtDNA的提取，建立起了一种操作简单且适用于花生mtDNA提取的方法，利用本发明专利技术方法可以有效提取花生mtDNA，所提取得到的mtDNA条带锐利，带型整齐，纯度高，稳定性好，可应用于克隆等分子实验以及高通量测序，满足线粒体遗传研究的需求，弥补了花生线粒体研究的缺陷。

【技术实现步骤摘要】
一种花生线粒体DNA的提取方法
本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及一种花生线粒体DNA的提取方法。
技术介绍
线粒体是植物维持生长发育必不可少的细胞器，也是核外重要的遗传体系。目前，利用新一代测序平台对线粒体DNA(简称mtDNA)进行高通量测序，对其序列信息进行深入解析，通过比较、分析基因组可以获得物种分类，系统进化等信息，对探究线粒体的起源和进化具有重要的意义。在线粒体的遗传研究中，提取高质量的mtDNA是对线粒体遗传体系进行深入研究的基本前提。植物mtDNA大多数为环状分子，每个线粒体中的DNA分子数从几拷贝到几十拷贝不等，且不同物种的mtDNA分子差别很大，从几十Kb到几千Kb不等，所以对于不同物种而言，其mtDNA的提取方法很难统一。总体来说，植物mtDNA的提取方法主要有密度梯度离心和差速离心等方法，其中，密度梯度离心法得到的mtDNA虽纯度高，但操作复杂，耗时；差速离心法虽然操作简单，但所提取的mtDNA纯度低，易降解。目前已在小麦，大白菜等作物中建立了比较成熟的mtDNA提取方法。而作为重要油料作物以及主要经济作物之一的花生，其mtDNA的提取却尚未建立起成熟的技术。因此，建立一种适用于提取高质量花生线粒体DNA的方法显得尤为必要。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的不足，本专利技术提出了一种花生线粒体DNA提取方法，该方法适用于花生mtDNA的提取，所提取得到的mtDNA纯度高，稳定性好，满足线粒体遗传研究的需求。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种花生线粒体DNA的提取方法，具体包括以下步骤：S1、取花生幼苗根组织，加入线粒体提取液充分研磨，所述线粒体提取液包括蔗糖，焦磷酸四钠，KH2PO4，EDTA，polyvinylpyrrolidone40，BSA，cysteine，ascorbicacid和甘油，pH7.5；S2、对步骤S1的提取物进行过滤，收集滤液；S3、步骤S2的滤液经离心后取上清液；S4、步骤S3的上清液经离心后收集沉淀；S5、往步骤S4的沉淀中加入裂解液，经悬浮后加入蛋白酶K和RNase，然后进行水浴处理，所述裂解液包括Hepes，KCl，MgCl2，ZnSO4，TritonX-100和SDS，pH7.5；S6、水浴后加入氯仿，颠倒混匀，然后进行离心处理；S7、离心后吸取上清液，加入异丙醇、糖原和醋酸钠，经颠倒混匀后置于-20℃中放置不少于2h；S8、放置结束后离心去除上清，收集沉淀即得花生线粒体DNA。本专利技术根据不同物种mtDNA提取方法的差异，结合不同物种mtDNA提取方法的特点并对其进行优化，在提取花生线粒体时，往提取液中加入甘油，对线粒体起保护作用；在沉淀mtDNA时，加入糖原，有利于提高mtDNA的沉淀效率，从而建立起了一种适用于花生mtDNA提取的方法，所提取得到的mtDNA条带锐利，带型整齐，纯度高，稳定性好，可应用于克隆等分子实验以及高通量测序，满足线粒体遗传研究的需求，对推动花生线粒体的研究具有重要意义。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤S1所述花生幼苗根组织与线粒体提取液的料液比(g/mL)为2:(3-5)；在本专利技术的另一个优选实施例中，所述花生幼苗根组织与线粒体提取液的料液比(g/mL)为1:2。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤S1所述线粒体提取液包括(0.2-0.4)M蔗糖，(4-6)mM焦磷酸四钠，(8-12)mMKH2PO4(磷酸二氢钾)，(1-3)mMEDTA(乙二胺四乙酸)，0.5％-1.5％[w/v]polyvinylpyrrolidone40(聚乙烯吡咯烷酮40)，0.5％-1.5％[w/v]BSA(牛血清白蛋白)，(4-6)mMcysteine(半胱氨酸)，(15-25)mMascorbicacid(抗坏血酸)和7％-13％[v/v]甘油，pH7.5；在本专利技术的另一个优选实施例中，所述线粒体提取液包括0.3M蔗糖，5mM焦磷酸四钠，10mMKH2PO4，2mMEDTA，1％[w/v]polyvinylpyrrolidone40，1％[w/v]BSA，5mMcysteine，20mMascorbicacid和10％[v/v]甘油，pH7.5。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤S3所述的离心为4℃，3000g离心不少于5min。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤S4所述的离心为4℃，20000g离心不少于10min。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤S5所述裂解液包括(40-60)mMHepes(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)，(100-200)mMKCl，(3-7)mMMgCl2，(5-15)μMZnSO4，0.5％-2％[v/v]TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)和0.03％-0.07％[v/v]SDS(十二烷基硫酸钠)，pH7.5；在本专利技术的另一个优选实施例中，所述裂解液包括50mMHepes，150mMKCl，5mMMgCl2，10μMZnSO4，1％[v/v]TritonX-100和0.05％[v/v]SDS，pH7.5。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤S6所述氯仿的加入量与步骤S5水浴后的混合液等体积。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤S7所述糖原的终浓度为(10-20)μg/mL。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤S7所述醋酸钠的终浓度为(0.2-0.4)M；在本专利技术的另一个优选实施例中，所述醋酸钠的终浓度为0.3M。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤S7所述异丙醇的加入量与所吸取的上清液等体积。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤S2所述过滤为采用两层滤布(Miracloth)过滤。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤S5所述蛋白酶K的终浓度为(50-100)μg/mL，所述RNase的终浓度为(10-20)μg/mL。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤S5所述沉淀与裂解液的料液比(g/mL)为1:5。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤S6所述的离心为4℃，12000rpm离心不少于10min。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤S6所述的水浴处理为60℃水浴45min-1h。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤S8所述的离心为4℃，12000rpm离心不少于10min。在本专利技术的一个优选实施例中，为方便mtDNA的保存以及使用，步骤S8提取得到花生线粒体DNA后用75％乙醇洗涤2次，置超净台吹干，加入50μL双蒸水溶解。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术提出了一种花生线粒体DNA提取方法，结合不同物种mtDNA提取方法的特点并对其进行优化，通过在线粒体提取液中加入甘油，并且在沉淀mtDNA时加入糖原，从而有利于花生mtDNA的提取，建立起了一种操作简单且适用于花生mtDNA提取的方法，利用本专利技术方法可以有效提取花生mtDNA，所提取得到的mtDNA条带锐利，带型整齐，纯度高，稳定性好，可应用于克隆等分子实验以及本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种花生线粒体DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1、取花生幼苗根组织，加入线粒体提取液充分研磨，所述线粒体提取液包括蔗糖，焦磷酸四钠，KH

【技术特征摘要】
1.一种花生线粒体DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、取花生幼苗根组织，加入线粒体提取液充分研磨，所述线粒体提取液包括蔗糖，焦磷酸四钠，KH2PO4，EDTA，polyvinylpyrrolidone40，BSA，cysteine，ascorbicacid和甘油，pH7.5；
S2、对步骤S1的提取物进行过滤，收集滤液；
S3、步骤S2的滤液经离心后取上清液；
S4、步骤S3的上清液经离心后收集沉淀；
S5、往步骤S4的沉淀中加入裂解液，经悬浮后加入蛋白酶K和RNase，然后进行水浴处理，所述裂解液包括Hepes，KCl，MgCl2，ZnSO4，TritonX-100和SDS，pH7.5；
S6、水浴后加入氯仿，颠倒混匀，然后进行离心处理；
S7、离心后吸取上清液，加入异丙醇、糖原和醋酸钠，经颠倒混匀后置于-20℃中放置不少于2h；
S8、放置结束后离心去除上清，收集沉淀即得花生线粒体DNA。


2.根据权利要求1所述的一种花生线粒体DNA的提取方法，其特征在于，步骤S1所述花生幼苗根组织与线粒体提取液的料液比为2:(3-5)。


3.根据权利要求2所述的一种花生线粒体DNA的提取方法，其特征在于，步骤S1所述线粒体提取液包括(0.2-0.4)M蔗糖，(4-6)mM焦磷酸四钠，(8-12)mMKH2PO4，(1-3)mMEDTA，0.5％-1.5％[w/v]polyvinylpyrrolidone40，0.5％-1.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晓云，李丽梅，李玲，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：广东;44