一种靶向获取里氏木霉纤维素酶调控基因的方法技术

本发明专利技术涉及农业生物技术领域，具体涉及一种靶向获取里氏木霉纤维素酶调控基因的方法。本发明专利技术通过差减杂交技术，获得里氏木霉在纤维素酶诱导分泌条件下基因表达升高或降低的差异表达的cDNA文库，对里氏木霉的差减基因进行RNA干扰，获得了纤维素酶酶活显著提高的转化子。

【技术实现步骤摘要】
一种靶向获取里氏木霉纤维素酶调控基因的方法
本专利技术涉及农业生物
，具体涉及一种靶向获取里氏木霉纤维素酶调控基因的方法。
技术介绍
里氏木霉的纤维素酶系包括两个外切纤维素酶、五个内切纤维素酶、一个b葡萄糖苷酶和三个裂解性多糖单加氧酶（lyticpolysaccharidesmonooxygenases,LPMOs，即原GH61家族成员）。对这些纤维素酶的分泌表达的调控非常复杂，涉及到多个阶段，如转录、翻译、转运、蛋白折叠、胞外降解等，每个调控过程都涉及多种关键调控因子，但目前对这些调控因子的认识还非常欠缺。里氏木霉的纤维素酶表达的转录调控、信号传导机制目前研究的还不清楚。基因调控涉及多个阶段，而里氏木霉中与纤维素酶活表达分泌密切相关的调控基因在哪个时期发挥调控作用并不清楚。目前，在里氏木霉中发现新的调控基因、揭示新调控机制的方法多依赖于对木霉随机诱变菌株的组学分析，从中分析突变基因并进行功能基因组学验证。显然，由于诱变常常导致基因组上多个基因组座位发生突变，难以直接确定哪个基因发挥了关键的调控作用，如果对每个突变位点都进行分析则需要很大的工作量。此外，借鉴对其它物种中已鉴定功能的调控基因，对它们在里氏木霉中的同源基因进行功能基因组学的分析，也能发现一些里氏木霉中的调控基因，但显然这种方法只能研究同源基因，并不能发现全新的调控途径。使用基因工程法建立微生物的突变体库，是一种有效的发现调控基因的办法。和上述提及的随机诱变所获得的突变体库不同，由于所构建的基因元件可方便的在工程菌中进行回溯，因此当得到理想的突变表型后，可快速的获取调控基因的信息。在一些转化效率高的生物体系中，可以通过基因工程方法，例如RNAi、CRISPR基因组编辑等方法，对全基因组范围内的基因进行缺失或沉默分析，从表型变化的菌株中获得调控基因的信息。然而，里氏木霉转化效率较低，一般每次转化数量为几十至几百个；对于具有工业应用价值的突变菌株来说，其转化效率更低，甚至每次转化只有几个到几十个。由于里氏木霉基因组包含上万个基因，因此这些转化子最理想情况下也只能对应于百分之一甚至千分之一水平上的基因，这样就导致上述建库方法并不适用于这些里氏木霉菌株。如果能获得相对于全基因组而言数量较少的基因亚群，对这些基因亚群采用基因工程方法进行操作，由此构建并获得里氏木霉的突变体库并进行筛选和功能验证就有可能快速得到关于调控基因的信息。里氏木霉在纤维素、葡萄糖、甘油、纤维二糖、槐二糖和木聚糖等多种不同的培养基中纤维素酶的表达情况不一致，这说明纤维素酶的基因表达和转录水平在这些不同条件下是不一样的。在纤维素培养基上，里氏木霉产酶量相对是最强的，因此相对应有的调控基因在纤维素培养基上，和其它碳源的培养上相区别必然发挥着不同的重要作用；由于在纤维素培养基上有上千基因的表达发生了变化，目前尚没有对这些基因的系统性分析，因此哪些基因在纤维素培养基上发挥了调控作用并不明确。此外，有许多调控基因（例如分子伴侣pdi1、转运蛋白sso等）在纤维素培养基中其转录水平并未发生特别明显的变化，因此也无法通过简单分析纤维素培养基上转录水平发生上调或下调变化的基因就能预测它们参与了纤维素酶的表达调控。本专利技术对里氏木霉在纤维素诱导培养基上转录水平发生变化的基因中是否包含调控基因进行了探索。SSH是一项可以快速获取两个mRNA群体中差异表达基因的分子生物学技术，是快速筛选差异表达基因的有效方法，也是寻找新基因的重要手段。在转录水平上研究基因表达的技术，可以获得低丰度差异表达基因，构建出一个差异表达的cDNA文库。RNA干扰（RNAi）技术提供了一种快速、有效抑制目的基因表达的方法，通过设计，使得细胞合成双链RNA、发卡状RNA或反义RNA等，诱导细胞内产生和目的mRNA互补的单链小分子RNA，再介导DICER对目的mRNA的切割和降解，从而降低目的基因的表达水平。RNAi的一大特点是：受到RNA干扰的受体菌株，其被调控基因的表达正好具有从高到低的一系列表达水平，反映在生物性状上，具有连续性的特点，而不是如基因敲除，在性状上呈现有或无截然不同的特点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种靶向获取里氏木霉纤维素酶调控基因的方法。根据本专利技术的靶向获取里氏木霉纤维素酶调控基因的方法，包括以下步骤：（1）构建里氏木霉在纤维素酶诱导分泌条件下转录水平基因表达升高或降低的差异表达cDNA文库（2）构建从步骤（1）所得cDNA文库中的差异表达cDNA的RNAi质粒，并转化入里氏木霉；（3）诱导里氏木霉转化子，筛选维素酶酶活发生变化的转化子，确定纤维素酶调控基因。根据本专利技术的靶向获取里氏木霉纤维素酶调控基因的方法，其中，在步骤（1）中，以在纤维素培养基中的cDNA作为参照，构建在葡萄糖中差异表达的cDNA文库；以葡萄糖培养基中的cDNA作为参照，构建在纤维素中差异表达的cDNA文库，从而获得里氏木霉在纤维素酶诱导分泌条件下转录水平基因表达升高或降低的差异表达cDNA文库。根据本专利技术的靶向获取里氏木霉纤维素酶调控基因的方法，其中，在步骤（2）中，将RNAi质粒转化入含红色荧光蛋白的里氏木霉菌株，可通过高通量筛选来获得“可提高纤维素酶酶活的”有效RNA干扰片段以及高产转化子。根据本专利技术的靶向获取里氏木霉纤维素酶调控基因的方法，其中，所述差减基因SSH进行RNA干扰的质粒是以pAPA-tel为模板构建而成，将pdc1启动子、SSH差减杂交基因库片段和eno1启动子的片段串联拼接而成的。根据本专利技术的靶向获取里氏木霉纤维素酶调控基因的方法，其中，所述纤维素酶调控基因的核苷酸序列如SEQIDNo：1所示。本专利技术将RNAi和SSH技术相结合，首先使用SSH技术获得在诱导期间特异变化的基因亚群。以此富集的基因亚群为基础进行RNAi质粒库的构建，再对里氏木霉转化本专利技术通过对里氏木霉的差减基因进行RNA干扰，获得了纤维素酶酶活显著提高的转化子。转化子在MM-Avicel中培养5天后，其中酶活最高的一株转化子，其纤维素酶的CMC酶活46.2U/mL，较出发菌株提高了4.2倍；对该菌株进行迭代进化，得到的转化子SUS4-SSH2(G16)酶活达75.6U/ml，比出发菌株SUS4提高了6倍。附图说明图1显示差减基因接头的扩增。图2为RNAi的差显基因转化子FACS分选图，其中A：SUS4-SSH(A)转化子FACS分选；B：SUS4-SSH(G)转化子FACS分选。图3显示RNAi-SSH转化子第6dEG活性及蛋白含量分析，其中，A:SUS4-SSH1(A)转化子酶活及蛋白含量分析；B:SUS4-SSH1(G)转化子酶活及蛋白含量分析。图4显示RNAi-SSH转化子酶活及蛋白浓度测定。具体实施方式本专利技术通过差减杂交技术，获得里氏木霉在纤维素酶诱导分泌条件下基因表达（转录水平上）升高或降低的差异表达的cDNA文库。设计引物，从里氏木霉TU-6的基因组DNA中扩本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向获取里氏木霉纤维素酶调控基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：/n（1）构建里氏木霉在纤维素酶诱导分泌条件下转录水平基因表达升高或降低的差异表达的cDNA文库；/n（2）构建步骤（1）所得cDNA文库中的差异表达cDNA基因的RNAi质粒，并转化入里氏木霉；/n（3）诱导里氏木霉转化子，筛选维素酶酶活发生变化的转化子，确定纤维素酶调控基因。/n

【技术特征摘要】
1.一种靶向获取里氏木霉纤维素酶调控基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）构建里氏木霉在纤维素酶诱导分泌条件下转录水平基因表达升高或降低的差异表达的cDNA文库；
（2）构建步骤（1）所得cDNA文库中的差异表达cDNA基因的RNAi质粒，并转化入里氏木霉；
（3）诱导里氏木霉转化子，筛选维素酶酶活发生变化的转化子，确定纤维素酶调控基因。


2.根据权利要求1所述的靶向获取里氏木霉纤维素酶调控基因的方法，其特征在于，在步骤（1）中，以在纤维素培养基中的cDNA作为参照，构建在葡萄糖中差异表达的cDNA文库；以葡萄糖培养基中的cDNA作为参照，构建在纤维素中差异表达的cDNA文库，从而获得里氏木...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏小运，姚斌，高飞，罗会颖，黄火清，王苑，柏映国，涂涛，王亚茹，张杰，师霞，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11