一种DNA产物的脱盐处理方法及单链DNA的制备和制备试剂盒技术

本发明专利技术公开一种DNA产物的脱盐处理方法及单链DNA的制备和制备试剂盒。该DNA产物脱盐处理方法，将琼脂糖、葡萄糖和无菌水混合加热熔融，然后冷却形成凝胶，并使得所述的凝胶上形成有可放入液体的空间，将DNA产物置于所述空间，冰上处理60‑120min，即可。脱盐后的DNA产物基本没有损耗，同时该脱盐处理方法操作简单，对环境、设备和人员素质的依懒性低。本发明专利技术提供序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的载体，解决了现有载体的酶切位点对制备ssDNA的限制性问题。

【技术实现步骤摘要】
一种DNA产物的脱盐处理方法及单链DNA的制备和制备试剂盒
本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种DNA产物的脱盐处理方法及单链DNA的制备和制备试剂盒。
技术介绍
成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)-相关联的(Cas)体系(CRISPR-Cas系统)用于哺乳动物细胞中所需基因组位点处的基因编辑。在CRISPR-Cas系统中，Cas9核酸酶通过与指导RNA(gRNA)复合而靶向至与gRNA互补的DNA区域，并切断DNA双链，细胞随即展开修复。如果修复过程中没有可供修复的DNA模板，修复的过程会引入大量的随机突变；如果提供修复模板，就有可能将修复模板整合在DNA中，从而引入设计的突变类型。本领域技术人员发现以单链脱氧核糖核酸(ssDNA)为同源重组修复模板进行基因敲入，具有随机插入概率低、编辑效率高等优势。ssDNA的制备方法主要有T7逆转录法、核酸外切酶法、变性高效液相色谱法、磁珠捕获法、不对称PCR、切刻酶制备法等。日本BiodynamicsLaboratoryInc提供的长单链DNA(ssDNA)制备试剂盒，使用Nicking切口酶法制备高纯度且有正确序列的长单链DNA(ssDNA1500base或3000base)。该试剂盒制备ssDNA的方法包括步骤：(1)对附加了目的DNA片段的质粒的MSC(多克隆位点)中两个切口酶位点之间或者是切口酶位点与限制酶位点之间进行克隆；(2)对克隆位点使用相应的切口酶和限制性内切酶消化质粒；(3)消化后的质粒经过乙醇沉淀脱盐处理后，通过附加的变性凝胶上样缓冲液进行变性，进行琼脂糖凝胶电泳；(4)切出跑在前端的条带，纯化后得到目的ssDNA。消化后质粒无法直接变性得到ssDNA，需要在变性前，采取乙醇沉淀法等方法对其进行脱盐处理。其中，乙醇沉淀法一方面会造成酶切产物的损耗，另一方面对操作人员素质和所用设备依赖度高。且对消化后质粒进行变性处理时需要加热，而加热容易导致ssDNA的降解。上述试剂盒所用载体pLSODN将所有可能用到的酶切位点全部添加到其序列中，这会导致：(1)目标序列插入时需根据所用酶切位点选择相对应的酶进行酶切连接，操作繁琐，不利于大规模制备；(2)无法使用载体中存在的切刻酶和限制性内切酶的酶切位点，限制了ssDNA的制备范围；(3)限制了ssDNA的长度，只能制备长度为200-3000nt的ssDNA。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，从而提供一种DNA产物的脱盐处理方法及单链DNA的制备和制备试剂盒。本专利技术提供一种DNA产物的脱盐处理方法，包括：将琼脂糖、葡萄糖和无菌水混合加热熔融，然后冷却形成凝胶，并使得所述的凝胶上形成有可放入液体的空间，将DNA产物置于所述空间，冰上处理60-120min。进一步地，加热熔融后，所述琼脂糖的浓度为6-16g/mL，葡萄糖的浓度为12-24g/mL。进一步地，所述DNA产物为PCR产物、酶切产物或质粒DNA等。本专利技术还提供一种单链DNA的制备方法，包括如下步骤：将目标DNA克隆到载体中，形成重组载体，所述目标DNA位于限制性内切酶和/或切刻内切酶酶切位点之间；使用相应的限制性内切酶和/或切刻内切酶消化所述重组载体；消化后的重组载体采用上述的脱盐处理方法进行脱盐处理；脱盐处理后的重组载体进行变性；变性后的重组载体进行琼脂糖凝胶电泳，切出目的条带，纯化后即得。进一步地，所述载体序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示。进一步地，采用平端连接、重组连接或粘性末端连接构建重组载体。进一步地，目标DNA两端添加限制性内切酶和/或切刻内切酶酶切位点后，与限制性内切酶酶切形成的平末端载体进行平末端连接。进一步地，目标DNA两端添加限制性内切酶和/或切刻内切酶酶切位点，形成序列1；根据限制性内切酶酶切形成的平末端载体，在序列1两端添加重组臂，形成序列2；序列2与平末端载体进行重组连接。进一步地，目标DNA两端添加限制性内切酶和/或切刻内切酶酶切位点，形成序列1；根据载体含有的限制性内切酶酶切位点，在序列1两端添加合适的限制性内切酶酶切位点，形成序列2；采用序列2两端的限制性内切酶处理序列2和载体，然后进行粘性末端连接。进一步地，在经脱盐处理的重组载体中加入其体积20％-30％的1mol/LNaOH，室温反应3-10min进行变性。本专利技术还提供一种载体，其序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示。本专利技术进一步提供一种单链DNA制备试剂盒，包括序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示的载体。进一步地，所述试剂盒还包括1mol/L的NaOH、EP管、枪头、琼脂糖、葡糖糖或无菌水。本专利技术技术方案，具有如下优点：1、本专利技术提供的DNA产物脱盐处理方法，脱盐后的DNA产物基本没有损耗，同时该脱盐处理方法操作简单，对环境、设备和人员素质的依懒性低。2、本专利技术提供的载体多克隆位点区仅保留少数酶切位点，采用平末端连接、重组连接或粘性末端连接可将目标DNA序列连接到载体中，解决了现有载体的酶切位点对制备ssDNA的限制性问题；扩大ssDNA的制备范围，能够制备200-4000nt长度的ssDNA；简化制备流程，便于大规模制备ssDNA。3、本专利技术提供的ssDNA的制备方法，对于相应限制性内切酶和/或切刻内切酶消化的重组载体采用盐离子在琼脂糖凝胶中自动扩散的原理进行脱盐处理，脱盐后的酶切产物基本没有损耗，同时该脱盐处理操作简单，对环境、设备和人员素质的依懒性低。4、本专利技术采用1mol/L氢氧化钠对脱盐后酶切产物进行变性，使DNA双链分离，该变性操作无需加热，可使用普通琼脂糖凝胶电泳，避免因加热导致的ssDNA降解问题以及使用特制的变性凝胶进行电泳分离而导致操作复杂的问题。附图说明图1为实施例1中琼脂糖凝胶电泳结果图；图2为实施例2中琼脂糖凝胶电泳结果图；图3为实施例3中琼脂糖凝胶电泳结果图；图4为实施例4中琼脂糖凝胶电泳结果图；图5为实施例5中琼脂糖凝胶电泳结果图；图6为实施例6中琼脂糖凝胶电泳结果图；图7为实施例7中琼脂糖凝胶电泳结果图；图8为实施例8中琼脂糖凝胶电泳结果图；图9为实施例9中琼脂糖凝胶电泳结果图；图10为载体pKSSD的图谱；图11为载体pKSSD-2000的图谱；图12为载体pKSSD-4000的图谱；其中，M表示marker，琼脂糖凝胶电泳结果图中marker为双链marker，相同长度的ssDNA和dsDNA在琼脂糖凝胶电泳中ssDNA的迁移速率更快。具体实施方式实施例1核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的单链DNA的制备方法，包括如下步骤：在核苷酸序列如SEQIDNO.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNA产物的脱盐处理方法，其特征在于，包括：将琼脂糖、葡萄糖和无菌水混合加热熔融，然后冷却形成凝胶，并使得所述的凝胶上形成有可放入液体的空间，将DNA产物置于所述空间，冰上处理60-120min。/n

【技术特征摘要】
1.一种DNA产物的脱盐处理方法，其特征在于，包括：将琼脂糖、葡萄糖和无菌水混合加热熔融，然后冷却形成凝胶，并使得所述的凝胶上形成有可放入液体的空间，将DNA产物置于所述空间，冰上处理60-120min。


2.根据权利要求1所述的脱盐处理方法，其特征在于，加热熔融后，所述琼脂糖的浓度为6-16g/mL，葡萄糖的浓度为12-24g/mL。


3.根据权利要求1所述的脱盐处理方法，其特征在于，所述DNA产物为PCR产物、酶切产物或质粒DNA。


4.一种单链DNA的制备方法，包括如下步骤：
将目标DNA克隆到载体中，形成重组载体，所述目标DNA位于限制性内切酶和/或切刻内切酶酶切位点之间；
使用相应的限制性内切酶和/或切刻内切酶消化所述重组载体；
消化后的重组载体采用权利要求1-3任一项所述的脱盐处理方法进行脱盐处理；
脱盐处理后的重组载体进行变性；
变性后的重组载体进行琼脂糖凝胶电泳，切出目的条带，纯化后即得。


5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述载体序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示。


6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，采用平端连接、重组连接或粘性末端连接构建重组载体。


7.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦尉，秦珂，陈业，吴昕，廖国娟，
申请(专利权)人：苏州金唯智生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32