海滨锦葵KvNAC基因的克隆方法及其表达载体的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种海滨锦葵KvNAC基因的克隆方法及其表达载体的构建方法，包括海滨锦葵总RNA的提取、海滨锦葵

【技术实现步骤摘要】
海滨锦葵KvNAC基因的克隆方法及其表达载体的构建方法
本专利技术涉及一种基因的克隆方法及其表达载体的构建方法。
技术介绍
植物固着生长的特性决定了植物体只能被动的遭受各类非生物胁迫(高温、冷害、冻害、干旱、高盐)对其带来的不利影响。为了抵御外界不良环境的影响，植物在长期的进化过程中也逐渐进化出一系列的生理和分子水平上防御机制。NAC(NAM,ATAF1/2,CUC2)转录因子是植物所特有的一类转录因子家族，其参与调节了植物体对多种非生物胁迫的应答响应。海滨锦葵是一种由国外引进的新的抗盐物种，目前对于其抗盐能力具体的分子机制研究很少，特别是还未发现对KvNAC基因的相关报道。植物的NAC转录因子具有N端高度保守的DNA结合结构域(NAC结构域)和复杂多变的C端转录激活结构域。其通过调节下游基因的转录激活或抑制参与植物体对多种生命活动的调节与应答响应。近年来其在拟南芥、水稻、玉米、芒草、苹果等植物中的生物学功能均有报道，在不同的植物体中表现出复杂多样化的生物学功能，而在盐生植物中具体的生物学功能目前还是未知的，因此从抗盐植物海滨锦葵中分离并鉴定新的NAC基因对阐明抗盐植物的耐盐机制和丰富充实耐盐基因资源具有重要作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种简便、有效的海滨锦葵KvNAC基因的克隆方法及其表达载体的构建方法。本专利技术的技术解决方案是：一种海滨锦葵KvNAC基因的克隆方法，其特征是：包括下列步骤：(一)海滨锦葵总RNA的提取：(1)向1.5mL离心管中加入1mLRNAisoPlusRNA提取液；(2)将所取海滨锦葵植物材料低温液氮迅速研磨成均匀的粉末，加0.1g研磨好的粉末于加好提取液的离心管中，涡旋震荡混匀，室温放置5min，4℃，12000g离心10min；(3)取上清1mL于新离心管中，加0.2mL氯仿抽提，震荡抽提15s，室温放置2-3min，4℃，12000g离心15min；(4)取上层水相500μL，加相同体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min，4℃，12000g离心10min；(5)75％预冷乙醇洗涤沉淀，4℃，7500g离心5min；(6)吸除上清，沉淀干燥后，50μLRNasefreeddH2O溶解；对提取的RNA进行RNA琼脂糖凝胶变性电泳，根据电泳结果的条带检测提取RNA的完整性和降解程度；用微量紫外分光光度计测定RNA的浓度和提取质量；检测合格后进行后续的反转录实验或-80℃冰箱保存备用；(二)海滨锦葵KvNAC基因的克隆和序列分析(1)用全式金公司生产的RNA反转录试剂盒TransScriptOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix进行反转录，获得cDNA；(2)按照RACE试剂盒SMARTTMRACEcDNAAmplificationKit的操作说明，首先以cDNA为模板，通过RACE技术克隆得到基因的5`端和3`端，然后以扩增获得的基因两端序列为依据设计基因全长的引物，最终从cDNA中克隆获得基因全长片段；RACE实验中用到的引物：NAC-GSP5`:GGCATAGCACCCAGTCATCAANAC-NGSP5`:GGCTTCCTGATAGGCTTGTCCNAC-GSP3`:GGGAGAAAGAGGTCCAGAGCCNAC-NGSP3`:AGATGGAGCAGTTGTCACCTTTG(3)RT-PCR的反应体系采用25μL体系，各成分和体积如下：PCR反应程序：预变性：94℃5min；变性：94℃30s，复性50-60℃30s，延伸72℃1-2min，从第2步开始循环30次；后延伸：72℃10min；PCR结束后，电泳观察，获得单一的扩增条带，将含有扩增条带的电泳胶切下，通过胶回收获得纯化的扩增的目的条带，通过测序获得KvNAC基因全长的基因片段；KvNAC基因全长1276bp，其中5`UTR328bp，3`UTR213bp，基因的ORF区为735bp，编码了244个氨基酸，该蛋白的分子量大小为28.26kD，等电点(PI)8.94；蛋白的不稳定系数为55.91，是一个不稳定的蛋白，同时其平均亲水系数为-0.848。还对海滨锦葵KvNAC基因在不同组织中表达情况进行测定；提取了海滨锦葵幼苗的根、茎和叶中的总RNA，通过反转录获得cDNA，用荧光定量RT-PCR测定KvNAC基因在锦葵不同组织中的表达情况，KvNAC基因在根、茎、叶中均有表达，表现出一定程度的组成型表达，其中根中的表达最高，是茎段中的3倍，叶片次之；说明其作为转录因子在植物体的各个组织中均通过调节下游靶基因的表达发挥重要作用。一种海滨锦葵KvNAC基因植物表达载体的构建方法，其特征是：根据获得的KvNAC基因全长，设计引物分离获得基因的ORF序列；引物序列如下：5`端：ATGGCGTTGTACGGTGAAAAG3`端：CTAATAAAATGGCTTCTGTAGG选用高保真的PfuDNA聚合酶进行PCR扩增，获得目的片段；取4μL的PCR产物与1μL的pEASY-BluntCloningVector载体进行连接反应，构建重组克隆载体；具体的实验操作流程参照全式金公司的pEASY克隆载体使用说明进行。本专利技术简便、有效；从一个新的抗盐物种中实现了基因的分离克隆，成功对其提取了总RNA，并实现其在该植物体的空间表达模式。表达载体的构建为基因功能的研究奠定了基础。附图说明下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明。图1是KvNAC基因的组织表达模式示意图。图2是KvNAC基因的PCR克隆及电泳凝胶成像示意图。图3是KvNAC基因植物表达载体的构建流程示意图。具体实施方式一种海滨锦葵KvNAC基因的克隆方法，包括下列步骤：(一)海滨锦葵总RNA的提取：实验过程中使用的所有实验用品(1.5mL离心管、各种型号的枪头、ddH2O、研钵和研棒)需采用121℃，50min的高温高压蒸汽灭菌，彻底除去RNase污染。提取过程中所用试剂为RNA提取专用，杜绝RNase的污染。提取试剂保存于冰箱4℃，整个试验的操作过程均在低温条件下进行，减少RNA的降解。(1)向1.5mL离心管中加入1mLRNAisoPlusRNA提取液；(2)将所取海滨锦葵植物材料低温液氮迅速研磨成均匀的粉末，加0.1g研磨好的粉末于加好提取液的离心管中，涡旋震荡混匀，室温放置5min，4℃，12000g离心10min；(3)取上清1mL于新离心管中，加0.2mL氯仿抽提，震荡抽提15s，室温放置2-3min，4℃，12000g离心15min；(4)取上层水相500μL，加相同体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min，4℃，12000g本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种海滨锦葵KvNAC基因的克隆方法，其特征是：包括下列步骤：/n(一)海滨锦葵总RNA的提取：/n(1)向1.5mL离心管中加入1mL RNAiso Plus RNA提取液；/n(2)将所取海滨锦葵植物材料低温液氮迅速研磨成均匀的粉末，加0.1g研磨好的粉末于加好提取液的离心管中，涡旋震荡混匀，室温放置5min，4℃，12000g离心10min；/n(3)取上清1mL于新离心管中，加0.2mL氯仿抽提，震荡抽提15s，室温放置2-3min，4℃，12000g离心15min；/n(4)取上层水相500μL，加相同体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min，4℃，12000g离心10min；/n(5)75％预冷乙醇洗涤沉淀，4℃，7500g离心5min；/n(6)吸除上清，沉淀干燥后，50μL RNase free ddH

【技术特征摘要】
1.一种海滨锦葵KvNAC基因的克隆方法，其特征是：包括下列步骤：
(一)海滨锦葵总RNA的提取：
(1)向1.5mL离心管中加入1mLRNAisoPlusRNA提取液；
(2)将所取海滨锦葵植物材料低温液氮迅速研磨成均匀的粉末，加0.1g研磨好的粉末于加好提取液的离心管中，涡旋震荡混匀，室温放置5min，4℃，12000g离心10min；
(3)取上清1mL于新离心管中，加0.2mL氯仿抽提，震荡抽提15s，室温放置2-3min，4℃，12000g离心15min；
(4)取上层水相500μL，加相同体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min，4℃，12000g离心10min；
(5)75％预冷乙醇洗涤沉淀，4℃，7500g离心5min；
(6)吸除上清，沉淀干燥后，50μLRNasefreeddH2O溶解；对提取的RNA进行RNA琼脂糖凝胶变性电泳，根据电泳结果的条带检测提取RNA的完整性和降解程度；用微量紫外分光光度计测定RNA的浓度和提取质量；检测合格后进行后续的反转录实验或-80℃冰箱保存备用；
(二)海滨锦葵KvNAC基因的克隆和序列分析
(1)用全式金公司生产的RNA反转录试剂盒TransScriptOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix进行反转录，获得cDNA；
(2)按照RACE试剂盒SMARTTMRACEcDNAAmplificationKit的操作说明，首先以cDNA为模板，通过RACE技术克隆得到基因的5`端和3`端，然后以扩增获得的基因两端序列为依据设计基因全长的引物，最终从cDNA中克隆获得基因全长片段；
RACE实验中用到的引物：
NAC-GSP5`:GGCATAGCACCCAGTCATCAA
NAC-NGSP5`:GGCTTCCTGATAGGCTTGTCC
NAC-GSP3`:GGGAGAAAGAGGTCCAGAGCC
NAC-NGSP3`:AGATGGAGCAGTTGTC...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤晓丽，刘晓华，朱琳，
申请(专利权)人：鲁东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37