使用CRISPR的高效体内敲入制造技术

本发明专利技术提供了用于体内基因组编辑的组合物、方法和试剂盒。本发明专利技术还提供了用于治疗体细胞组织疾病的组合物、方法和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用CRISPR的高效体内敲入相关申请本申请要求2018年1月5日提交的美国专利申请号62/614,229的优先权，出于所有目的将其全部内容通过引用以其全文特此并入。专利技术背景已经证明基因组编辑工具，例如锌指核酸酶(ZFN)(Urnov等人.,NatureReviewGenetics,11:636-46(2010))、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)(Sung等人.,NatureBiotechnology,31:23-24(2013)和成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)(Cho等人.,NatureBiotechnology,31:230-2(2013))是用于产生经遗传修饰的细胞和动物的有效工具。基因组编辑工具能以多种不同的方式起作用，包括通过缺失、插入、突变或取代特定的核酸序列来改变细胞的基因组。这些基因组改变可以是基因特异性的或位置特异性的。上述经工程化的核酸酶可以切割细胞基因组中明确的DNA序列以产生DNA双链断裂(DSB)，并通过非同源末端连接(NHEJ)或同源定向重组(HDR)修复机制刺激DNA修复(Kim等人.,NatureReviewGenetics,15:321-34,(2014))。通常，“敲除”基因被认为比“敲入”基因更容易，因为通过核酸酶复合物引入基因组的DSB被NHEJ更快地修复。NHEJ诱导的突变比HDR介导的遗传修饰发生的频率更高，因为NHEJ贯穿整个细胞周期发生，而HDR仅在S和G2期发生(Deriano和Roth,Annu.Rev，Genet.[遗传学年度评论],47:433-55,(2013))。因此，与NHEJ诱导的突变相比，HDR介导的精确遗传修饰的效率相对较低(Lombardo等人.,Nat.Biotechnol.,25,1298-1306,2007)。基因疗法是治疗遗传性疾病的有前景的策略，但由于治疗性基因向活组织递送的低效以及当前技术提供的不稳定性和短暂性表达，在过去的二十年中，基因疗法一直受到很大的阻碍。迄今为止，使用经工程化的核酸酶的两种基因组编辑方法-基因破坏和基因校正-已在治疗应用中显示出显著的前景。基因破坏涉及刺激NHEJ以在遗传元件中创建靶向的插入缺失(indel)，通常会导致对受试者有益的功能丧失(LOF)突变。相反，基因校正使用HDR直接逆转引起疾病的突变，恢复功能，同时保留经校正的元件的生理调节。HDR还可以用于将治疗性转基因插入基因组中明确的“安全港(safeharbor)”基因座以恢复缺失的基因功能。然而，通过HDR在体内敲入治疗性基因的效率非常低。NHEJ是一种DNA修复机制，通过所述机制，一个或多个核苷酸从DSB的末端插入或缺失(插入缺失)以促进断裂末端的连接(Lieber,Annu.Rev.Biochem.,79,181-211,(2010))。NHEJ介导的DSB修复通常会导致移码突变，从而引入提前终止密码子或导致无义介导的mRNA转录物衰变——有效地“敲除”所述基因。先前，并未考虑用NHEJ将基因插入细胞的基因组中，因为为了获得功能性基因和所得蛋白质，需要更高的插入精度来避免移码突变。因此，基因“敲入”方法常规地依赖于HDR，一种更精确但效率较低的DNA修复机制，其依赖于DNA模板进行DNA修复。例如，研究人员已经报道，当NHEJDNA修复途径被抑制时(例如，通过失活连接酶IV、KU70和KU80(Chu等人,NatureBiotechnology,33,543-548(2015))；通过引入SCR7(Lin等人.,ScientificReports,6,34531(2016)))，或当HDRDNA修复途径增强时(例如，通过共表达RAD52(Shao等人，InternationalJournalofBiochemistryandCellBiology,InPress,(2017))，或通过施用AcrIIA4来使Cas9无法切口(Shin等人.,ScienceAdvances,3,1701620(2017)))，由CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑被增强。本专利技术人先前使用无同源性供体检测了外源DNA的体外基因组整合(美国临时专利申请号62/256,514和62/288,974；美国专利申请号15/354,329；和He,X.,等人.Knock-inoflargereportergenesinhumancellsviaCRISPR/Cas9-inducedhomology-dependentandindependentDNArepair.NucleicAcidsRes44,e85(2016))。结果表明CRISPR/Cas9偶联的NHEJ修复机制能以高效率介导大DNA片段的敲入；并且本文建立的新型敲入方法在所有经检测的人细胞系中均显著优于通常使用的基于HDR的敲入策略(美国临时专利申请号62/256,514和62/288,974；美国专利申请号15/354,329；和He,X.,等人.Knock-inoflargereportergenesinhumancellsviaCRISPR/Cas9-inducedhomology-dependentandindependentDNArepair.NucleicAcidsRes44,e85(2016))。在这里，专利技术人证明了使用基因特异性供体载体，结合基因座特异性辅助构建体和通用型辅助构建体，通过CRISPR/Cas9偶联的NHEJ将大的DNA片段(包括基因)体内“敲入”到活生物体的体细胞组织中，以有效地将所需基因插入宿主细胞基因组中预先选定的基因座中。大DNA片段(例如本文使用的基因)的靶向基因组整合的发展提供了长期基因表达的潜力，从而导致产生足够水平的编码蛋白或mRNA以治疗活生物体中的各种疾病。专利技术简述在第一方面，本专利技术提供了用于将所需基因插入宿主细胞基因组中选定的基因座的方法，例如，插入在所选遗传基因座的3’UTR处，其中所述宿主细胞在活生物体内。通过NHEJ修复机制进行操作，所述方法包括使宿主细胞或活生物体与以下项接触的步骤：(i)供体载体，其编码所需基因、任选的在基因5’端处的内部核糖体进入位点(ires)元件、以及一个或两个sgRNA靶位点；(ii)基因座特异性辅助载体，其编码至少一个(任选地多于一个，例如两个或更多个)与宿主细胞基因组中选定的核酸序列互补的sgRNA；(iii)通用型辅助载体，其编码至少一个与供体载体中一个或两个sgRNA靶位点互补的sgRNA，例如，所述靶位点在所选基因座的3’UTR处；以及如果所述基因座特异性辅助载体或通用型辅助载体不编码Cas或Cpf1蛋白时的(iv)Cas或Cpf1蛋白，从而使所述供体载体线性化以形成供体DNA片段，从而供体DNA片段通过NHEJ介导的敲入进入活生物体的宿主细胞基因组。(iv)中的所述Cas或Cpf1蛋白能以其蛋白质形式或以其编码多核苷酸序列的形式(例如，包含编码Cas或Cpf1蛋白的多核苷酸序列并能够指导所述蛋白质表达的表达盒或载本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在宿主细胞基因组中选定基因座处插入所需基因的方法，其中所述宿主细胞在活生物体内，所述方法包括：/n使活生物体与以下项接触：/n(i)供体载体，其编码所需基因和一个或两个sgRNA靶位点；/n(ii)基因座特异性辅助载体，其编码至少一个小指导RNA(sgRNA)，所述小指导RNA与宿主细胞基因组中的选定核酸序列互补；/n(iii)通用型辅助载体，其编码至少一个sgRNA，所述sgRNA与供体载体中的一个或两个sgRNA靶位点互补；和/n如果所述基因座特异性辅助载体或通用型辅助载体不编码Cas或Cpfl蛋白时的(iv)Cas或Cpfl蛋白，/n从而使所述供体载体线性化以形成供体DNA片段，从而使所述供体DNA片段通过NHEJ介导的敲入进入到所述活生物体的宿主细胞基因组中。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180105 US 62/614,2291.一种在宿主细胞基因组中选定基因座处插入所需基因的方法，其中所述宿主细胞在活生物体内，所述方法包括：
使活生物体与以下项接触：
(i)供体载体，其编码所需基因和一个或两个sgRNA靶位点；
(ii)基因座特异性辅助载体，其编码至少一个小指导RNA(sgRNA)，所述小指导RNA与宿主细胞基因组中的选定核酸序列互补；
(iii)通用型辅助载体，其编码至少一个sgRNA，所述sgRNA与供体载体中的一个或两个sgRNA靶位点互补；和
如果所述基因座特异性辅助载体或通用型辅助载体不编码Cas或Cpfl蛋白时的(iv)Cas或Cpfl蛋白，
从而使所述供体载体线性化以形成供体DNA片段，从而使所述供体DNA片段通过NHEJ介导的敲入进入到所述活生物体的宿主细胞基因组中。


2.如权利要求1所述的方法，其中所述供体载体进一步包含在所需基因5’末端处的内部核糖体进入位点(ires)元件。


3.如权利要求1所述的方法，其中在所选基因座的3’UTR处插入所需基因，并且其中至少一个由所述基因座特异性辅助载体编码的小指导RNA(sgRNA)与所选基因座3’UTR处的选定的核酸序列互补。


4.如权利要求1所述的方法，进一步包括从获得自活生物体的样品检测由插入的所需基因编码的蛋白质或RNA。


5.如权利要求1所述的方法，进一步包括从获得自活生物体的样品评估插入的所需基因的功能性。


6.如权利要求1所述的方法，其中所述供体载体包含一个或两个sgRNA靶位点。


7.如权利要求1所述的方法，其中所述供体载体包含一个或多个所需基因。


8.如权利要求1所述的方法，其中所述基因座特异性辅助载体编码Cas9。


9.如权利要求1所述的方法，其中所述通用型辅助载体编码Cas9。


10.如权利要求1所述的方法，其中所述供体载体、基因座特异性辅助载体和/或通用型辅助载体选自质粒、AAV病毒颗粒、腺病毒颗粒、慢病毒颗粒和DNA纳米颗粒复合物。


11.如权利要求1所述的方法，其中将所述供体载体、基因座特异性辅助载体和通用型辅助载体作为AAV病毒颗粒进行递送。


12.如权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞在活生物体的肝内。


13.如权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞是造血干细胞。


14.如权利要求1所述的方法，其中所述活生物体是患有遗传性疾病的人。


15.如权利要求1所述的方法，其中所述活生物体是患有糖尿病的人。


16.如权利要求1所述的方法，其中所述供体载体包含hINS基因和一个或两个sgRNA靶位点。


17.如权利要求1所述的方法，其中所述活生物体是患有乙型血友病的人。


18.如权利要求15所述的方法，其中所述供体载体包含hF9基因和一个或两个sgRNA靶位点。


19.如权利要求1所述的方法，其中所选基因座是Actb、Alb或GAPDH。


20.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个指导RNA包含约20个核苷酸的核酸区，其与宿主细胞基因组中的所选核酸序列互补。


21.一种用于在受试者中治疗体细胞组织疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的以下项：
(a)供...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯波，何向军，
申请(专利权)人：香港中文大学，
类型：发明
国别省市：中国香港;81