一种高效表达AFP3-PTEN融合蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种高效表达AFP3‑PTEN融合蛋白的方法，属于生物技术领域，本发明专利技术把HBx基因克隆到构建的表达载体中，把构建的载体转染人肝癌细胞，肝癌细胞内表达HBx蛋白后，把AFP第3个结构域和全长PTEN基因连接到表达载体，并转染到表达HBx蛋白的人肝癌细胞中，肝癌细胞内表达HBx蛋白，HBx蛋白促进人类AFP3‑PTEN融合蛋白的高效分泌表达，浓缩纯化培养基获得AFP3‑PTEN融合蛋白。本发明专利技术肝癌细胞表达的AFP3‑PTEN融合蛋白能抑制细胞增殖，它们使NIH 3T3细胞增殖能力下降了15％～60％。而对照蛋白AFP却使细胞增殖能力明显提高22～125％。血清白蛋白却没有显著促进NIH 3T3细胞增殖能力。本发明专利技术获得的AFP3‑PTEN融合蛋白可以用于肿瘤治疗的研究。

【技术实现步骤摘要】
一种高效表达AFP3-PTEN融合蛋白的方法
本专利技术属于生物
，涉及基因工程及蛋白质工程，尤其涉及AFP(人类甲胎蛋白)第3个结构域和PTEN(人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因)融合表达与纯化的方法。
技术介绍
甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)基因在胎儿发育过程开放表达，而在人出生两年后基本处于关闭状态，但是成人发生肝癌时，AFP的基因重新被激活而大量表达，因而AFP被用作诊断肝癌的标准，AFP可以通过其受体进入癌细胞。因此AFP也可以作为靶向药物的载体，携带抗癌药物等进入癌细胞，从而杀死癌细胞。PTEN蛋白可通过拮抗酪氨酸激酶等的活性而抑制肿瘤的进展。AFP3-PTEN融合蛋白表达的目是通过AFP第3个结构域把PTEN蛋白带入癌细胞，有助于靶向抑制癌细胞活性。目前，经检索尚未见关于利用肝癌细胞高效表达与纯化融合蛋白AFP3-PTEN方法的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了一种利用肝癌细胞高效表达与纯化AFP3-PTEN融合蛋白的方法，该表达的蛋白活性较好，可以用于癌症治疗的研究。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案为：提供一种高效表达AFP3-PTEN融合蛋白的方法，其中：把HBx基因克隆到构建的表达载体中，把构建的载体转染人肝癌细胞，肝癌细胞内表达HBx蛋白后，把AFP第3个结构域和全长PTEN基因连接到表达载体，并转染到表达HBx蛋白的人肝癌细胞中，肝癌细胞内表达HBx蛋白，HBx蛋白促进人类AFP3-PTEN融合蛋白的高效分泌表达，浓缩纯化培养基获得AFP3-PTEN融合蛋白。进一步地，本专利技术高效表达AFP3-PTEN融合蛋白的方法，具体包括以下步骤：(1)表达载体的构建a、表达HBx肝癌细胞系的建立根据人类HBx基因序列(NCBI登录号为AB210819)，把合成基因用XbaI和XhoI双酶切，用T4连接酶连接到表达载体PTT5(Invitrogen)，转化DH5α细胞后提取质粒，得到PTT5-HBx表达载体，把PTT5-HBx转染肝癌细胞系48h后，得到表达HBx的肝细胞系；b、把AFP基因(GenBank:NM_001134的第3个结构域，第401～610个残基的基因，具体合成的基因序列如序列表中SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示)和PTEN全长基因(NP_000305.2，具体合成的基因序列如序列表中SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示)连接起来，并在其C端加上6×His标签；把合成基因用XbaI和XhoI双酶切，用T4DNA连接酶连接到哺乳动物表达载体PTT5(Invitrogen)，转化DH5α细胞后提取质粒，得到PTT5-AFP3-PTEN质粒；c、将HBx全长基因克隆到表达载体PTT5载体中，转化DH5α细胞后提取质粒，得到PTT5-HBx质粒；(2)把表达载体转染人肝癌细胞把PTT5-HBx质粒转染人肝癌细胞48小时后，再转染PTT5-AFP3-PTEN质粒，48～96小时后收集培养基；(3)AFP3-PTEN融合蛋白的纯化将以上收集培养基加入HBS(10mMHepes，pH7.2，150mMNaCl)溶液，通过滤膜浓缩，把浓缩溶液吸附到镍柱上，然后用洗脱液洗脱，把洗脱液通过凝胶柱纯化，再进一步通过滤膜浓缩及冷冻干燥，得到AFP3-PTEN融合蛋白。进一步地，所述AFP3-PTEN融合蛋白分子量为68～72KD；它功能与AFP不同，AFP促进细胞增殖，而AFP3-PTEN融合蛋白却抑制细胞增殖。进一步地，所述肝癌细胞系是用于实验、未有传染相关报道的HLE、HepG2或Bel-7402肝癌细胞。进一步地，所述肝癌细胞是转染了HBx的表达载体，并表达HBx蛋白的肝癌细胞。所述的获得AFP3-PTEN融合蛋白是AFP第3个结构域后面带有PTEN蛋白，因此通过AFP第3个结构域把PTEN蛋白带入到癌细胞中，从而抑制癌细胞增殖。肝癌细胞表达的AFP3-PTEN融合蛋白能抑制细胞增殖，它们使NIH3T3细胞增殖能力下降了15％～60％。而对照蛋白AFP却使细胞增殖能力明显提高22～125％。血清白蛋白却没有显著促进NIH3T3细胞增殖能力。本专利技术获得的AFP3-PTEN融合蛋白可以用于肿瘤治疗的研究。附图说明图1：AFP3-PTEN融合蛋白表达载体(PPT5-AFP3-PTEN)电泳图。1：Marker；2:重组质粒PPT5-AFP3-PTEN；重组质粒PPT5-AFP3-PTEN用XbaI和XhoI双酶切验证，2000bp处有AFP3-PTEN大小的片段，说明连接正确。图2：肝癌细胞表达的AFP3-PTEN融合蛋白的SDS-PAGE电泳图。1：proteinMarker；2～4：不同时间表达的AFP3-PTEN融合蛋白。图3：[3H]掺入法测定AFP、HSA(血清白蛋白)、AFP3-PTEN融合蛋白对NIH3T3的增殖能力的影响。用一定量的(0～80mg/L)AFP处理NIH3T3细胞24h，细胞增殖能力明显提高22～125％。而HLE、Hepg2或Bel-7402肝细胞表达的AFP3-PTEN融合蛋白却抑制细胞增殖，它们使NIH3T3细胞增殖能力下降了15％～60％。血清白蛋白却没有显著促进NIH3T3细胞增殖能力。具体实施方式实施例一利用HLE细胞高效表达与纯化AFP3-PTEN融合蛋白的方法1、表达HBx的HLE细胞的建立根据人类HBx基因序列(NCBI登录号为AB210819)，把合成基因用XbaI和XhoI双酶切，用T4连接酶连接到表达载体PTT5(Invitrogen)，转化DH5α细胞后提取质粒，然后转染HLE细胞，培养48小时后检测HBx蛋白的表达。2、将含有PTT5-AFP3-PTEN质粒转染到表达HBx的HLE细胞中，培养48h后，收集培养基。3、AFP3-PTEN融合蛋白分离纯化和鉴定。由于蛋白为分泌表达，所以将培养基与细胞混合物8000r/min离心5min后，取上清通过切向流膜浓缩切换溶液，溶液为HBSbuffer(10mMHepes，pH7.2，150mMNaCl)。然后挂镍柱，用300mmol/L的咪唑冲洗。然后再继续用凝胶色谱(AKAT，spudex200柱)纯化，流动相为HBS(10mMHepes，pH7.2，150mMNaCl)。表达融合蛋白的分子量约68～72KD。4、HLE表达的AFP3-PTEN融合蛋白能抑制癌细胞生长。[3H]掺入法测定AFP、HSA(血清白蛋白)、AFP3-PTEN融合蛋白对NIH3T3的增殖能力的影响。用一定量的(0-80mg/L)AFP处理NIH3T3细胞24h，细胞增殖能力明显提高22～125％。而HLE肝细胞表达的AFP3-PTEN融合蛋白却抑制细胞增殖，它们使NIH3T3细胞增殖能力下降了14％～57％。血清白蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效表达AFP3-PTEN融合蛋白的方法，其特征在于：把HBx基因克隆到构建的表达载体中，把构建的载体转染人肝癌细胞，肝癌细胞内表达HBx蛋白后，把AFP第3个结构域和全长PTEN基因连接到表达载体，并转染到表达HBx蛋白的人肝癌细胞中，肝癌细胞内表达HBx蛋白，HBx蛋白促进人类AFP3-PTEN融合蛋白的高效分泌表达，浓缩纯化培养基获得AFP3-PTEN融合蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.一种高效表达AFP3-PTEN融合蛋白的方法，其特征在于：把HBx基因克隆到构建的表达载体中，把构建的载体转染人肝癌细胞，肝癌细胞内表达HBx蛋白后，把AFP第3个结构域和全长PTEN基因连接到表达载体，并转染到表达HBx蛋白的人肝癌细胞中，肝癌细胞内表达HBx蛋白，HBx蛋白促进人类AFP3-PTEN融合蛋白的高效分泌表达，浓缩纯化培养基获得AFP3-PTEN融合蛋白。


2.根据权利要求1所述的高效表达AFP3-PTEN融合蛋白的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)表达载体的构建
a、把AFP第3个结构域基因和PTEN全长基因克隆到表达载体PTT5载体中，其C端加上6个组氨酸序列，转化DH5α细胞后提取质粒，得到PTT5-AFP3-PTEN质粒；
b、将HBx全长基因克隆到表达载体PTT5载体中，转化DH5α细胞后提...

【专利技术属性】
技术研发人员：林波，朱明月，李伟，董栩，刘坤，李孟森，
申请(专利权)人：海南医学院，
类型：发明
国别省市：海南;46