一种piggyBac转座子高通量遗传筛选方法技术

本发明专利技术提供一种piggyBac转座子高通量遗传筛选方法，包括步骤：1)构建PB[tet‑on‑SD]载体，包含piggyBac缺陷转座子、反式四环素调控激活因子rtTA表达框和受tetO操纵子调控启动的剪接供体；2)将PB[tet‑on‑SD]质粒和编码piggyBac转座酶的质粒同时转染体外培养细胞；3)在培养基中加入四环素衍生物doxcycline药物诱导内源基因过表达；4)对细胞表型进行分析，对具有特定表型的细胞克隆进行插入突变定位，从而确定过表达后会引起特定表型的基因。本发明专利技术的piggyBac转座子高通量遗传筛选方法，能够在体外培养细胞中高效便捷地进行全基因组过表达的高通量遗传筛选。

【技术实现步骤摘要】
一种piggyBac转座子高通量遗传筛选方法
本专利技术涉及一种piggyBac转座子高通量遗传筛选方法，属于生物

技术介绍
高通量遗传筛选是通过大规模高效地突变个体或细胞的基因组，而后针对特定生物学表型对突变个体或细胞进行筛选，从而发现在该生物学过程中起作用的基因。高通量遗传筛选被广泛地用于功能基因组研究、药物靶点探索和耐药机理研究。基因突变能造成基因功能的缺失(loss-of-function)或者获得(gain-of-function)。基因过表达是获得型基因突变的一种。目前，高通量基因过表达遗传筛选主要采用在细胞中使用慢病毒导入cDNA文库的方法。该方法涉及cDNA文库建立、慢病毒包装等步骤，操作较为繁琐。cDNA文库的组织来源和质量直接限制了遗传筛选对基因组的覆盖度。迄今为止，在生物学领域还缺乏一种在体外培养细胞中高效便捷地进行全基因组过表达高通量遗传筛选的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于piggyBac转座子随机诱导内源基因过表达进行高通量遗传筛选的方法。以在体外培养细胞中高效便捷地进行过表达高通量遗传筛选。本专利技术采用了如下技术方案：一种piggyBac转座子高通量遗传筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：1)构建PB[tet-on-SD]载体，包含piggyBac缺陷转座子、反式四环素调控激活因子rtTA表达框和受tetO操纵子调控启动的剪接供体；2)将PB[tet-on-SD]质粒和编码piggyBac转座酶的质粒同时转染体外培养细胞，介导PB[tet-on-SD]载体随机插入体外培养细胞基因组；3)在培养基中加入四环素衍生物doxcycline药物诱导内源基因过表达；4)对细胞表型进行分析，对具有特定表型的细胞克隆进行插入突变定位，从而确定过表达后会引起特定表型的基因。进一步，本专利技术的piggyBac转座子高通量遗传筛选方法，PB[tet-on-SD]载体所包含的元件从5’端到3’端依次是：PBR：piggyBac转座子右臂；UBC：人泛素C启动子；rtTA：反式四环素调控激活因子；IRES：内部核糖体进入位点序列；puro：嘌呤霉素puromycin抗性基因；WPRE：旱瀨肝炎病毒转录后调控元件；PA：兔β-球蛋白polyA；Ins：绝缘子Insulator序列；tetO：四环素操纵子序列；SD：剪接供体序列；PBL：piggyBac转座子左臂。进一步，本专利技术的piggyBac转座子高通量遗传筛选方法，还具有这样的特征：步骤4)中，对细胞表型进行分析的步骤包括进行遗传筛选的步骤。进一步，本专利技术的piggyBac转座子高通量遗传筛选方法，还具有这样的特征：其中，步骤2)中，所述体外细胞采用遗传筛选获得PLX4032耐药的携带BRAFV600K突变的黑色素瘤细胞克隆。进一步，本专利技术的piggyBac转座子高通量遗传筛选方法，还具有这样的特征：步骤1)中，构建PB[tet-on-SD]载体包括：步骤1-1，合成LUN-SD序列，酶切插入缺陷piggyBac转座子AgeI和BglII位点间，获得PB[SD]载体。进一步，本专利技术的piggyBac转座子高通量遗传筛选方法，还具有这样的特征：步骤1)中，构建PB[tet-on-SD]载体包括：步骤1-2，合成UBC-rtTA-IRES-puro-WPRE序列(SEQIDNo：2)酶切插入PB[SD]载体MluI和PstI位点间，获得PB[rtTA,SD]载体。进一步，本专利技术的piggyBac转座子高通量遗传筛选方法，还具有这样的特征：步骤1)中，构建PB[tet-on-SD]载体包括：步骤1-3，使用引物PAF和PAR，以pCAG-EGFP质粒为模板，扩增兔β-球蛋白polyA序列，PstI酶切插入PB[rtTA,tetO-SD]载体PstI位点，获得PB[rtTA-PA,tetO-SD]载体。进一步，本专利技术的piggyBac转座子高通量遗传筛选方法，还具有这样的特征：步骤1)中，构建PB[tet-on-SD]载体包括：步骤1-4，合成Ins序列(SEQIDNo：7)NotI酶切补平，插入经XbaI酶切补平后的PB[rtTA-PA,tetO-SD]载体，最终获得PB[tet-on-SD]载体。进一步，本专利技术的piggyBac转座子高通量遗传筛选方法，还具有这样的特征：步骤4)中，对具有特定表型的细胞克隆进行插入突变定位的步骤如下：连有Splinkerette接头的基因组DNA文库经piggyBac转座子臂特异引物(左臂：PBLlink1,SEQIDNo：10)和接头特异引物(LinkAmp1,SEQIDNo：11)进行第一轮PCR扩增。扩增后得到的产物再经piggyBac转座子臂特异引物(左臂：PBLlink2,SEQIDNo：12)和接头特异引物(LinkAmp2,SEQIDNo：13)进行第二轮巢氏PCR扩增。巢氏PCR扩增产物被用于Sanger测序。测序得到的插入位点周旁基因组序列与基因组公开数据库中的序列进行比对，从而确定转座子的插入位点。专利技术的有益效果本专利技术的piggyBac转座子高通量遗传筛选方法，能够在体外培养细胞中高效便捷地进行全基因组过表达的高通量遗传筛选。附图说明图1是本专利技术PB[tet-on-SD]载体的示意图。图2是PB[tet-on-SD]载体介导体外培养细胞内源基因过表达的方案示意图。图3是本专利技术piggyBac转座子基因过表达高通量遗传筛选应用于耐药机理研究的一个实施例。具体实施方式以下结合附图来说明本专利技术的具体实施方式。本专利技术在体外培养细胞中高效便捷地进行全基因组过表达高通量遗传筛选的一个实施例中，携带tet-on系统的piggyBac转座子被用于诱导转座子插入位点旁内源基因条件性过表达，从而进行耐药机理研究的遗传筛选。在制备本实施例中携带tet-on系统的piggyBac转座子载体的过程中，所涉及的质粒抽提，质粒转化，大肠杆菌培养，PCR，酶切，Klenow酶补平，连接为本领域人员所熟知的实验。常规实验条件可参照M.R.格林和J.萨姆布鲁克编著的《分子克隆实验指南》第四版。携带tet-on系统的piggyBac转座子载体PB[tet-on-SD]的具体建立步骤是：合成LUN-SD序列,见SEQIDNo：1，酶切插入缺陷piggyBac转座子AgeI和BglII位点间，获得PB[SD]载体。合成UBC-rtTA-IRES-puro-WPRE序列,见SEQIDNo：2，酶切插入PB[SD]载体MluI和PstI位点间，获得PB[rtTA,SD]载体。合成tetO序列,见SEQIDNo：3，酶切插入XbaI和Age本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种piggyBac转座子高通量遗传筛选方法，其特征在于，包括：/n1)构建PB[tet-on-SD]载体，包含piggyBac缺陷转座子、反式四环素调控激活因子rtTA表达框和受tetO操纵子调控启动的剪接供体；/n2)将PB[tet-on-SD]质粒和编码piggyBac转座酶的质粒同时转染体外培养细胞，介导PB[tet-on-SD]载体随机插入体外培养细胞基因组；/n3)在培养基中加入四环素衍生物doxcycline药物诱导内源基因过表达；/n4)对细胞表型进行分析，对具有特定表型的细胞克隆进行插入突变定位，从而确定过表达后会引起特定表型的基因。/n

【技术特征摘要】
1.一种piggyBac转座子高通量遗传筛选方法，其特征在于，包括：
1)构建PB[tet-on-SD]载体，包含piggyBac缺陷转座子、反式四环素调控激活因子rtTA表达框和受tetO操纵子调控启动的剪接供体；
2)将PB[tet-on-SD]质粒和编码piggyBac转座酶的质粒同时转染体外培养细胞，介导PB[tet-on-SD]载体随机插入体外培养细胞基因组；
3)在培养基中加入四环素衍生物doxcycline药物诱导内源基因过表达；
4)对细胞表型进行分析，对具有特定表型的细胞克隆进行插入突变定位，从而确定过表达后会引起特定表型的基因。


2.如权利要求1所述的piggyBac转座子高通量遗传筛选方法，其特征在于：
其中，PB[tet-on-SD]载体所包含的元件从5’端到3’端依次是：
PBR：piggyBac转座子右臂；
UBC：人泛素C启动子；
rtTA：反式四环素调控激活因子；
IRES：内部核糖体进入位点序列；
puro：嘌呤霉素puromycin抗性基因；
WPRE：旱瀨肝炎病毒转录后调控元件；
PA：兔β-球蛋白polyA；
Ins：绝缘子Insulator序列；
tetO：四环素操纵子序列；
SD：剪接供体序列；
PBL：piggyBac转座子左臂。


3.如权利要求1所述的piggyBac转座子高通量遗传筛选方法，其特征在于：
步骤4)中，对细胞表型进行分析的步骤包括进行遗传筛选的步骤。


4.如权利要求1所述的piggyBac转座子高通量遗传筛选方法，其特征在于：
其中，步骤2)中，所述体外细胞采用遗传筛选获得PLX4032耐药的携带BRAFV600K突变的黑色素瘤细胞克隆。


5.如权利要求1所述的piggyBac转座子高通量遗传筛选方法，其特征在于：
步骤1)中，构建PB[tet-on-SD]载体包括：
步骤1-1，合成LUN-SD序列，酶切插入缺陷piggyBac...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘雨堃，
申请(专利权)人：潘雨堃，
类型：发明
国别省市：上海;31