一种农杆菌介导的番茄遗传转化方法技术

本发明专利技术涉及植物基因工程技术领域，提供了一种农杆菌介导的番茄遗传转化方法。所述方法具体包括：无菌番茄叶片外植体的获得；农杆菌侵染叶片外植体；外植体的抗性筛选；外植体的继代培养；外植体的生根培养；转基因植株的移土培养；本发明专利技术方法简化了遗传转化的程序，整体过程较为简单，有效地缩短了转化周期；使得转基因后代遗传趋于稳定，操作简单，外源基因得到了表达水平明显提升，使得转化效率大大提高。

Agrobacterium mediated genetic transformation of Tomato

【技术实现步骤摘要】
一种农杆菌介导的番茄遗传转化方法
本专利技术涉及植物基因工程
，具体涉及一种农杆菌介导的番茄遗传转化方法。
技术介绍
番茄属于茄科家族，作为世界范围内广泛种植的蔬菜和经济作物，具有基因组小(950Mb)、生长周期短(45-100d)，可自花授粉等优点，也是培育转基因植物和植物生物制药产品的模式植物。近些年来，全球生产的番茄总量也在大幅攀升，成为了许多国家矿物质和维生素成份的重要来源之一。1986年，McCormick等第一次提出用农杆菌介导的叶盘法转化番茄，该方法以番茄的子叶和下胚轴作为外植体，用单一序列和多拷贝序列作为外源基因，获得了多达8哥番茄品种的300多株转基因苗。2000年，VIDYA等利用农杆菌介导法转化番茄子叶，转化率仅为8％。2003年，PARK等利用农杆菌介导得叶盘法转化番茄，转化效率提高到了20％。2015年，SUN等利用农杆菌介导法转化番茄的子叶和下胚轴，转化效率已经40％。番茄得遗传转化研究不断进步发展，时至今日，转化效率仍有很大差异，较低的不足10％，较高的能达到80％以上，甚至可达100％。与此本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种农杆菌介导的番茄遗传转化方法，其特征在于，具体包括：/n步骤一：无菌番茄叶片外植体的获得/n11)在超净台中，用无菌镊子拔出子叶完全展开、真叶还未长出的Micro-Tom番茄无菌幼苗，将无菌幼苗的根置于无菌水中，防止失水；/n12)在T1培养基上放置一张无菌滤纸，用无菌眼科剪将无菌幼苗子叶剪成0.5～1cm大小，背面超上，均匀放置在T1培养基平皿上；/n13)封口膜封住平皿，置于暗箱中，温度25℃条件下预培养2d；/n步骤二：农杆菌侵染叶片外植体/n21)挑去含有目的基因质粒的农杆菌单菌落于2～3mLLB培养基中，并加入相应的抗生素，28℃的温度条件下在200rpm摇床培养12～16h...

【技术特征摘要】
1.一种农杆菌介导的番茄遗传转化方法，其特征在于，具体包括：
步骤一：无菌番茄叶片外植体的获得
11)在超净台中，用无菌镊子拔出子叶完全展开、真叶还未长出的Micro-Tom番茄无菌幼苗，将无菌幼苗的根置于无菌水中，防止失水；
12)在T1培养基上放置一张无菌滤纸，用无菌眼科剪将无菌幼苗子叶剪成0.5～1cm大小，背面超上，均匀放置在T1培养基平皿上；
13)封口膜封住平皿，置于暗箱中，温度25℃条件下预培养2d；
步骤二：农杆菌侵染叶片外植体
21)挑去含有目的基因质粒的农杆菌单菌落于2～3mLLB培养基中，并加入相应的抗生素，28℃的温度条件下在200rpm摇床培养12～16h，至菌体完全复苏；
22)取500μL菌液加到新的10mLLB培养基，并加入相应的抗生素，28℃的温度条件下在200rpm摇床培养5～6h，至菌液浓度OD600达到0.5～0.6；
23)在转速为5000rpm的条件下离心10min，收集菌体，弃上清，用无菌水悬浮菌体；
24)重复步骤23)，用无菌水悬浮菌体，并将菌液浓度OD600稀释至0.08～0.12；
25)将置于暗箱中预培养2d的无菌叶片收集在无菌平皿中，倒入菌液，浸染5min，此过程中不断摇晃平皿，保证叶片接触到菌液；
26)弃菌液，用枪头将多余菌液尽量吸干后，将叶片背面朝上，均匀摆放在放有新滤纸的T1培养基上；
27)封口膜封住平皿，温度25℃的条件下置于暗箱中共培养2d；
步骤三：外植体的抗性筛选
31)将共培养2d的叶片正面向上均匀摆放至分化选择培养基——T21培养基上，封口膜封住平皿，温度25℃的条件下光照培养，其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；
32)为保证T21培养基的营养成分和抗性效价满足叶片的生长和抗性筛选，5d后将叶片转移至新的T21培养基上；
33)每10d更换一次T21培养基，至愈伤组织分化出的芽可以移至芽伸长培养基——T22培养基；
步骤四：外植体的继代培养
41)为促进外植体愈伤组织分化出的芽进一步生长和伸长发育，将其转移至含有芽伸长培养基T22培养瓶中，温度25℃条件下光照培养；其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；
42)为保证T22培养基的营养成分和抗性效价满足芽的伸长伸长生长和抗性筛选，每14d更换一次T22培养基，直至芽伸长3～5cm；
步骤五：外植体的生根培养
51)当T22培养基中的芽伸长至3～5cm时，将具有芽分化生长点的愈伤组织拔出，剪下具有分化生长点的芽，插入含有生根培养基T3的培养瓶中，温度25℃条件下光照培养；其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；
52)2～3周，可以见到幼根；
53)至根生长丰富可见须根，幼苗叶片丰富，将转基因幼苗移出培养瓶；
步骤六：转基因植株的移土培养
61)转基因幼苗根须发达，叶片丰富时，可转移至培养土中生长；
62)将转基因幼苗从T3培养基中拔出，洗净根上培养基，将根埋入已经完全润湿的培养土中，压实；
63)用塑料膜罩上植株，避免失水；光照培养1～2周，转基因苗适应环境后，慢慢将塑料膜移除；光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式。


2.如权利要求1所述的一种农杆菌介导的番茄遗传转化方法，其特征在于，步骤一所述无菌幼苗的种植方法为：
1)在超净台中，取一定数量的Micro-Tom种子放入无菌平皿，倒入浓度为75％的无水乙醇，浸洗5min，弃溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟兰环，王宇，史学群，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：海南;46