一种热带爪蛙心肌诱导损伤及示踪品系的制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种热带爪蛙心肌诱导损伤及示踪品系的制备方法与应用。本发明专利技术利用热带爪蛙心肌细胞特异性启动子mlc2，以及NTR基因和Dendra2基因的密码子优化技术成功构建了热带爪蛙心肌诱导损伤及示踪品系Mlc2‑NTR‑T2A‑Dendra2

【技术实现步骤摘要】
一种热带爪蛙心肌诱导损伤及示踪品系的制备方法与应用
本专利技术涉及基因工程
，特别涉及一种热带爪蛙心肌诱导损伤及示踪品系的制备方法及应用。
技术介绍
心血管疾病是影响我国人口健康的重大致死疾病之一，其根本原因在于成年哺乳动物无法修复与再生受损的心肌组织。热带爪蛙(Xenopustropicalis)是爪蛙属中唯一具有真正二倍体遗传背景的两栖类模式动物，具有个体小、发育快、体外受精、繁殖量大、培育费用低、早期胚胎透明等特点。而且，热带爪蛙蝌蚪阶段的尾巴、神经系统及变态期的肢体均能进行有效的修复与再生，已经发展成为再生医学领域的理想模式动物。最新研究进展表明，成体热带爪蛙的心尖组织用外科手术方法切除后，损伤的心肌组织能够有效的进行自我修复与再生(Liaoetal.,HeartregenerationinadultXenopustropicalisafterapicalresection.CellBiosci.2017,7:70)，进而提示我们：成体热带爪蛙的心脏具有很强的再生能力。因此，热带爪蛙模式动物可为心脏修复与再生的机制研究、药物筛选及干预疗法建立提供良好的模型与研究思路，已经成为再生医学领域的研究热点与前沿。目前，基于上述动物模型开展的心脏修复与再生领域的研究主要利用外科手术造模的方法：即开胸后，对心尖组织进行切除，进而建立心肌损伤模型，并用于研究心肌修复与再生的作用机制、药物筛选及再生疗法建立等。然而，这种通过开胸暴露心脏组织，并手术切除心尖等部位的心肌损伤模型的造模方法仍然存在严重不足：1)手术建模对动物个体本身将造成严重的创伤；2)伤口感染不易控制，容易引起动物死亡；3)切除心尖组织的大小难以标准化；4)对手术人员的技术要求较高；5)手术造模的重复性难以控制等。上述不利因素将对造模的成功率、动物存活率及实验结果产生重要的不利影响。而且，利用上述手术方法对野生型模式动物造模后，对于再生的心肌组织的细胞来源也难以进行精确的分析，仍然需要借助于额外的用于研究细胞命运示踪的遗传修饰品系等手段才能实现。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种热带爪蛙心肌诱导损伤及示踪品系的制备方法。本专利技术的另一目的在于提供上述制备方法的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种热带爪蛙心肌诱导损伤及示踪品系的制备方法，包括如下步骤：(1)克隆热带爪蛙心肌特异性基因mlc2的启动子序列；(2)以热带爪蛙为宿主，对NTR基因和Dendra2基因的编码序列进行密码子优化(optimizing,opt)，合成密码子优化后的NTR-T2A-Dendra2opt融合基因编码框；(3)将步骤(1)中mlc2的启动子序列克隆到pBS-ISceI载体的XhoI与EcoRI酶切位点之间，再将步骤(2)的NTR-T2A-Dendra2opt融合基因编码框及SV40polyA(pA)终止信号序列(NTR-T2A-Dendra2opt-pA)克隆到mlc2的启动子下游的EcoRI与NotI酶切位点之间，得到靶基因密码子优化后的转基因载体(pMlc2-NTR-T2A-Dendra2opt)；(4)将步骤(3)的转基因载体与I-SceI归位内切酶共同注射热带爪蛙受精卵的动物极，孵育，筛选心脏特异性表达绿色荧光的F0胚胎，培养至成蛙；(5)将步骤(4)的成蛙与野生型杂交，筛选具有生殖传递能力的F1代胚胎，培养至成蛙，鉴定，得到热带爪蛙心肌诱导损伤及示踪品系(Mlc2-NTR-T2A-Dendra2opt)。步骤(1)中所述的mlc2的启动子序列为mlc2基因TSS上游3.1kb大小的DNA片段。所述的mlc2的启动子序列的扩增引物如下：mlc2-F(XhoI)：5’-ccCTCGAGATCTGGGAATGCGTAAAGATGCTCCTAC-3’；mlc2-R(EcoRI)：5’-cgGAATTCGCAGAGGAACTCTGAGGCCACTCTGATC-3’。上述扩增引物中的下划线及5’端碱基为额外加入的酶切位点序列及其保护碱基。步骤(2)中所述的密码子优化后的NTR-T2A-Dendra2opt融合基因编码框DNA序列如下所示：上述序列中下划线是指经密码子优化后的NTR编码区，小写字母是指经密码子优化后的T2A连接肽编码区，方框内的序列是指经密码子优化后的Dendra2编码区。步骤(3)中所述的转基因载体中EcoRI酶切位点与NTR起始密码子之间添加gccacc碱基序列；Dendra2与pA之间加入HpaI酶切位点。步骤(4)中所述的转基因载体与I-SceI归位内切酶的注射方式为：200ng转基因载体和20UI-SceI归位内切酶以无菌水配置成10μL的注射液，每个受精卵注射2nL。步骤(4)中所述的共同注射热带爪蛙受精卵为注射入1细胞期受精卵的动物极。步骤(4)中所述的孵育为孵育胚胎至45期(St45)。步骤(4)和(5)中所述的筛选采用荧光体式显微镜。步骤(5)中所述的具有生殖传递能力的F1代转基因胚胎为心脏特异性表达Dnendra2绿色荧光的胚胎。步骤(5)中所述的鉴定为利用原位杂交技术检测F1代的蝌蚪中转基因的表达模式，并在F1代的热带爪蛙成体心脏组织中检测转基因的表达与功能。上述热带爪蛙心肌诱导损伤及示踪品系的制备方法在筛选促进心肌修复与再生的药物或疗法中的应用。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：本专利技术利用热带爪蛙心肌细胞特异性启动子mlc2及密码子优化技术，成功构建了热带爪蛙心肌诱导损伤及示踪品系Mlc2-NTR-T2A-Dendra2opt，该品系不但可以特异性地标记或删除心肌细胞，而且可利用UV照射及Dendra2蛋白的荧光转换特性，对心肌损伤后再生的心肌细胞进行标记与示踪。同时，该品系可用于高通量筛选，为筛选有效促进心肌修复与再生的药物及疗法提供了有力的模型工具。附图说明图1是NTR-T2A-Dendra2融合基因的结构及其密码子优化情况检测结果图；其中，A为NTR-T2A-Dendra2融合基因编码框的结构图；B为以热带爪蛙为表达宿主对融合基因进行密码子优化的结果。图2是pBS-ISceI载体的图谱。图3是靶基因密码子优化后的转基因载体pMlc2-NTR-T2A-Dendra2opt的图谱。图4是发育至St28期和St38期的F1代转基因品系阳性蝌蚪的原位杂交检测结果图。图5是发育至St45期的F1代转基因品系阳性蝌蚪的原位杂交及荧光成像检测结果图；其中，A为野生型及转基因品系爪蛙胚胎中Dnedra2基因的原位杂交检测结果(myh6探针用作阳性对照)；B为野生型及转基因爪蛙胚胎中Dendra2蛋白的荧光成像检测结果；C为野生型及转基因品系爪蛙胚胎用Mtz(1mM)连续诱导7天后的存活率及死亡率统计结果。图6是F1代成本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种热带爪蛙心肌诱导损伤及示踪品系的制备方法，其特征在于包括如下步骤：/n(1)克隆热带爪蛙心肌特异性基因mlc2的启动子序列；/n(2)以热带爪蛙为宿主，对NTR基因和Dendra2基因的编码序列进行密码子优化，合成密码子优化后的NTR-T2A-Dendra2

【技术特征摘要】
1.一种热带爪蛙心肌诱导损伤及示踪品系的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)克隆热带爪蛙心肌特异性基因mlc2的启动子序列；
(2)以热带爪蛙为宿主，对NTR基因和Dendra2基因的编码序列进行密码子优化，合成密码子优化后的NTR-T2A-Dendra2opt融合基因编码框；
(3)将步骤(1)中mlc2的启动子序列克隆到pBS-ISceI载体的XhoI与EcoRI酶切位点之间，再将步骤(2)的NTR-T2A-Dendra2opt融合基因编码框及SV40polyA终止信号序列NTR-T2A-Dendra2opt-pA克隆到mlc2的启动子下游的EcoRI与NotI酶切位点之间，得到靶基因密码子优化后的转基因载体pMlc2-NTR-T2A-Dendra2opt；
(4)将步骤(3)的转基因载体与I-SceI归位内切酶共同注射热带爪蛙受精卵的动物极，孵育，筛选心脏特异性表达绿色荧光的F0胚胎，培养至成蛙；
(5)将步骤(4)的成蛙与野生型杂交，筛选具有生殖传递能力的F1代胚胎，培养至成蛙，鉴定，得到热带爪蛙心肌诱导损伤及示踪品系Mlc2-NTR-T2A-Dendra2opt。


2.根据权利要求1所述的热带爪蛙心肌诱导损伤及示踪品系的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的mlc2的启动子序列为mlc2基因TSS上游3.1kb大小的DNA片段；
步骤(2)中所述的密码子优化后的NTR-T2A-Dendra2opt融合基因编码框DNA序列如下所示：






上述序列中下划线是指经密码子优化后的NTR编码区，小写字母是指经密码子优化后的T2A连接肽编码区，方框内的序列是指经密码子优化后的Dendra2编码区。


3.根据权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐绪峰，蔡冬青，郑莉，周毅民，梁炽谦，冯珊珊，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东;44