本发明专利技术建立了一种合成三聚氰胺完全抗原的方法和应用单克隆抗体检测三聚氰胺的直接竞争ＥＬＩＳＡ试剂盒。试剂盒的组成包括：三聚氰胺酶标物、三聚氰胺标准液、包被三聚氰胺单克隆抗体的酶标板、底物显色液、洗涤液、终止液、酶标物稀释液及样品稀释液等。本发明专利技术建立了人工合成三聚氰胺完全抗原的方法，以多聚赖氨酸为载体制备单克隆抗体；应用单克隆抗体制备的ＥＬＩＳＡ试剂盒，具有简单、快速、处理样品量大、灵敏度较高、特异性强和价格低廉等诸多优点，适和工厂化生产，可对液态牛奶、奶粉、固体样品中三聚氰胺进行快速检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种人工合成三聚氰胺完全抗原的方法，尤其是提供了应用单克隆抗 体术研制的检测三聚氰胺的ELISA试剂盒，同时还公开了其制备方法，属于酶联免疫
技术介绍
三聚氰胺(melamine)简称三胺，学名三氨三嗪，别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺， 是一种重要的氮杂环有机化工原料。这种化学品常被用于生产塑料、胶水和阻燃剂。 三聚氰胺含氮量为66. 6%，折合成粗蛋白含量为416.27%，掺入少量就可以迅速提高蛋 白含量，使产品在常规检査中显得含有较高的蛋白质，常被不法商贩冒充成高蛋白物 质加入，以提高检测时食品中蛋白质检测数值，还能大幅度降低成本。由于三聚氰胺 不溶解在水里，抗氨氮测定，加上三聚氰胺为白色粉末，易被染色，很容易混入原料 中而不被发现。所以一般的分析化验部门很难分析出来。国际化学品安全规划署和欧洲联盟委员会合编的《国际化学品安全手册》(第三 巻)表明长期或反复大量摄入三聚氰胺可能对肾与膀胱产生影响，导致产生结石， 因此三聚氰胺是一种禁止用于食品及动物饲料的化学物质。目前，三聚氰胺检测方法主要是气相色谱法和高效液相色谱法。高效液相色谱法 虽操作简单，但检出限较高，无法满足对三聚氰胺低残留限量的要求；气相色谱法灵 敏度较高，但样品前处理过程复杂、分析速度慢，不适合在基层推广使用；并且气相 色谱法和高效液相色谱法需要昂贵的专门设备，不适合现场检测，对检测人员的技术 要求较高。基于抗原抗体特异性反应建立起来的ELISA检测方法，具有简单、快速、处理样 品量大、灵敏度较高、特异性强和价格低廉等诸多优点，可以直接用于生产实践。
技术实现思路
本专利技术公开一种人工合成三聚氰胺完全抗原的方法，用于制备单克隆抗体或多克 隆抗体。本专利技术还提供了应用单克隆抗体检测三聚氰胺的直接竞争ELISA检测试剂盒的制备方法，适合工厂化生产。本专利技术公开的人工合成三聚寧J安完全抗原是通过以下方法得到的 以三聚氰胺为半抗原，通过戊二醛法与多聚赖氨酸偶联制备完全抗原。 本专利技术提供的ELISA检测试剂盒的组成包括三聚氰胺酶标物、三聚氰胺标准液、包被三聚氰胺单克隆抗体的酶标板、底物显 色液、洗涤液、终止液、酶标物稀释液及样品稀释液等。所述单克隆抗体为以三聚氰胺为半抗原，通过与多聚赖氨酸偶联制备完全抗原， 并通过小鼠免疫、细胞融合、筛选及克隆化培养制得；所述三聚氰胺酶标物采用化学 方法偶联得到，标记酶为辣根过氧化物酶，所述方法为过碘酸钠法；所述样品稀释液 为含0.1 %吐温-20的PBST缓冲液，pH值为7. 4;所述洗涤液为含0.05 %吐温-20的PBST 缓冲液，pH值为7. 4;所述酶标物稀释液为含0.01 %吐温-20的PBST缓冲液，pH值为 7.4;底物显色液A液为O. lmol/LpH值为5.0的醋酸钠-柠檬酸缓冲液配制成0.3% 过氧化氢储备液，每lmL缓冲液加入14uL储备液，制成使用液；B液为四甲基联苯胺， 先用丙酮配成0. 2mg / mL溶液，用0. lmol / LpH值为5. 0的醋酸钠-柠檬酸缓冲液配制 成O. 2mg/L溶液。另一方面，本专利技术还提供检测样品中三聚氰胺含量的方法，歩骤如下(1) 样品前处理(2) 用权利要求2所述的ELISA检测试剂盒检测，向包被三聚氰胺单抗的酶标 板孔中加入标准品或样品溶液，加入三聚氰胺酶标物，孵育30分钟，洗涤液洗涤，加 入显色液孵育20分钟，终止液终止反应，用酶标仪测定吸光度值。(3) 分析检测结果 本专利技术人工合成三聚氰胺完全抗原的原理为戊二醛(GA)是一种同型双功能交联剂，它的两个功能基可以与多聚赖氨酸和三聚 氰胺上的氨基结合，形成多聚赖氨酸-GA-三聚氰胺的结合物。用两步法先将多聚赖氨 酸与过量的GA反应，形成二者的结合物，然后再将该结合物与抗体蛋白质分子的氨 基交联，形成多聚赖氨酸-GA-三聚氰胺的结合物，制备成三聚氰胺的完全抗原，可用 于免疫动物制备单克隆抗体或多克隆抗体。本专利技术试剂盒的检测原理为将抗三聚氰胺的单克隆抗体包被于固相载体上，加入样本或三聚氰胺标准品溶液 并加入三聚氰胺酶标物，待检样品中的三聚氰胺与三聚氰胺酶标物竞争包被于固相载体上的单克隆抗体，通过洗涤除去未结合的三聚氰胺酶标物，加入显色液显色后终止 反应，测定样品吸光度值，改值与样品中三聚氰胺的量呈负相关，与标准曲线比较即 可测定样品中三聚氰胺的浓度。 本专利技术的积极效果在于本专利技术首次公开一种新的合成三聚氰胺完全抗原的方法，为制备单克隆抗体或多克隆抗体奠定了基础；并首次应用单克隆抗体建立了一种检测三聚氰胺的直接竞争ELISA试剂盒，可定性或定量分析样品中的三聚氰胺，适和工厂化生产。本专利技术的试剂盒縮短了检测时间，对样品的前处理要求低，处理过程简单，并配备了相关的样品处理试剂，能够同时迅速检测大批样品。本专利技术的试剂盒所有试剂均为己配制好的工作液，可以直接操作无需处理，减少了操作步骤，可以快速，灵敏检测液态牛奶、奶粉、固体样品中的三聚氰胺，避免了复杂的操作，对设备要求低，可以适应多种检测环境，以及多种检测需要；并且本专利技术的试剂盒样本用量小，试剂保存时间长，自动化程度高，对操作者无毒性，对环境无污染等；因此本专利技术应用单克隆抗体建立的ELISA检测试剂盒具有重大的社会意义和广阔的市场前景。 附图说明图l.三聚氰胺抑制曲线。 具体实施例方式通过以下实施例进一步举例描述本专利技术，并不以任何方式限制本专利技术，在不背离 本专利技术的技术解决方案的前提下，对本专利技术所作的本领域普通技术人员容易实现的任 何改动或改变都将落入本专利技术的权利要求范围之内。实施例1制备三聚氰胺完全抗原通过戊二醛法使三聚氰胺与多聚赖氨酸偶联制备完全抗原，具体步骤如下1. 取100mg多聚赖氨酸溶于20 mL pH7. 2 PBS中，加入2 mL50y。戊二醛，4(TC作 用18h。2. 用0. 15mol/LNaCl平衡过的S印hadex G-50凝胶柱洗脱，除去游离的戊二醛， 或用0.01mol/L， pH7.2PBS， 4。C透析过夜，期间更换透析液三次。3. 用lmol/L pH9. 6碳酸盐缓冲液调节洗脱液或透析液pH值至9. 0 9. 6，将100mg 三聚氰胺直接溶于洗脱液或透析液中，37'C作用18h。4. 装入透析袋，以O. 01mol/L、 pH7.2PBS， 4'C透析过夜。cm DCTQnnn 、Vfe始4悉士p;、、,齿4in 、雄县cno/画+Kvti 'l、县AJl士 orw^/口力/ ij i lvjuuuu n、刁pi fix， A)H/、寸里"u/u 口 Yfq ，'J'里乂J农，1 L巩厶UV^I不1卞o用此方法制备的完全抗原可直接免疫动物，制备单克隆抗体或多克隆抗体。实施例2三聚氰胺特异性单克隆抗体的制备用实施例1方法制备的完全抗原作为免疫原，选用健康8周龄雌性BALB/C小鼠作 为免疫动物，免疫剂量lmg/只，采取腹腔注射，每次免疫间隔为2周，免疫5次。初 次免疫用免疫原与弗氏完全佐剂(体积比=1: 1)注射，二、三、四次免疫抗原与等量 弗氏不完全佐剂混合，最后一次不加佐剂用2倍量免疫，3天后取小鼠脾细胞与Sp2/0 骨髓瘤细胞杂交融合，制备杂交瘤细胞。采取有限稀释法筛选杂交瘤细胞，筛选能够本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人工合成三聚氰胺完全抗原的方法，其特征在于：以三聚氰胺为半抗原，通过戊二醛法与多聚赖氨酸偶联制备完全抗原。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：雷连成，杜崇涛，孙长江，冯新，韩文瑜，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]
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