一种结核菌感染的酶联免疫斑点诊断试剂盒及特异性抗原制取方法，其试剂盒包括试剂盒体、以及设置在盒体中的检验试剂，所述的检验试剂包括阳性标准液、显色剂、浓缩洗涤剂和稀释液，它还包括结核分枝杆菌特异性抗原、包被的抗ＩＮＦ－γ抗体和载体蛋白偶联物的酶标二抗；所述结核分枝杆菌特异性抗原为结核分枝杆菌ＥＳＡＴ－６和ＥＩＳ基因表达的融合蛋白；所述的抗ＩＮＦ－γ抗体为鼠源性ＩｇＧ抗体。特异性抗原制取方法是筛选合适的结核菌特异性抗原ＥＳＡＴ－６与ＥＩＳ组合，制成的重组融合蛋白含有二者主要的抗原决定簇。本发明专利技术重组融合蛋白明确含有适合不同ＨＬＡ限制的Ｔ细胞表位，不会因为不同人群由于ＨＬＡ分布不同而影响结果。通过对不同人群的结核病人和健康人的临床测试，本发明专利技术已显示出比当前同类产品更优异的特异性和灵敏性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种结核菌感染的酶联免疫斑点诊断试剂盒及特异性抗原制取 方法，它属于医学免疫诊断学
技术介绍
结核病(Tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染性疾病， 是当前感染性疾病的头号杀手，全球有约1/3的人口感染结核菌，每年有约800 万新发结核病例，死亡170万。造成上述严重流行情况的原因是多方面的，其中， 缺乏早期、特异、敏感的诊断技术和试剂是一个重要原因。目前结核病和结核菌 感染的诊断主要有以下技术l)微生物学检查，包括细菌涂片显微镜;险查、结 核菌培养、核酸检测；2)免疫学检查，包括抗体检测、PPD皮试、特异性IFN - Y检测。除特异性IFN-Y检测外，其他检测技术的敏感性和/或特异性均不 理想。针对特异性IFN- y;f全测，目前市场上已有主要应用抗原为30KD, 14KD, 19KD蛋白等的结核菌感染血清诊断试剂盒，并且通过进一步联合应用ESAT-6蛋 白提高了对结核菌检测的敏感性和特异性以满足临床的需要。但由于这些试剂盒 采用特异性多肽抗原容易受到不同人群白细胞抗原(HLA)分布的差别而影响结 果，同时，不同地区结核菌及其他分技杆菌感染情况也影响检测的结果。因此， 上述试剂盒在像中国这样的发展中国家人群中检测效果并不理想。同时，这些试 剂盒(澳大利亚的Cellestis公司生产的Quantiferon - TB - Gold试剂盒和英国 Oxford Im肌m公司生产的T. Spot - TB试剂盒)价格昂贵，不适合中国市场使用。 近年来，几种包括EIS (enhance intracellular survival)蛋白在内的新发现 的结核菌抗原极有可能明显改变这方面的缺失。作为 一种可溶性分泌型蛋白，EIS 在早期的研究中被确认为结核分枝杆菌的特异性抗原。本专利技术者在2006年对EIS 蛋白作过充分的研究并证实了 EIS作为结核菌抗原的特异性。但EIS能提高结核 菌在巨噬细胞中的生存能力并促进结核菌往其他正常淋巴细胞扩散被认为是主 要的致病因子并导致Thl/Th2免疫调节紊乱，因此EIS并未被应用于结核菌感染 检测。另一方面，目前结核病治疗缺乏客观、量化的疗效判定指标。目前结控部门 推行的短期化疗标准疗程，没有充分考虑治疗个体化因素。结核病治疗疗程的确 定的主要依据l)痰细菌学检查结果， 一般的病人在抗痨治疗2个月内即转为 阴性，此后的治疗不可能再有细菌学检查结果作为检测的依据；2)放射学检查， 以病变的阴影变化为依据来指导治疗，但绝大部分病人在经过急性期后，阴影的 改变不明显，而且也很难定量分析，更难以客观。因此，这些指标均不能客观和 量化的评^T结核病抗痨治疗的效果。而结核病的治疗除考虑合理的医疗费用外， 还有两个特殊性l)抗痨治疗的副作用大，过渡治疗增加毒副作用发生的几率， 2)患者体内残留的结核菌是结核病人再发的重要原因，疗程不足是复发的主要 原因。因此，需要一种能够全程、客观、量化的判断标准来评价结核病的的治疗 效果。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有克服现有结核菌感染酶联免疫斑点检测试剂 特异性和敏感性不足的结核菌感染酶联免疫斑点诊断试剂盒以及特异性抗原制 耳又方法。本专利技术的目的是这样实现的一种结核菌感染的酶联免疫斑点诊断试剂盒，它包括试剂盒体、以及设置在 盒体中的检验试剂，所述的检验试剂包括阳性标准液、显色剂、浓缩洗涤剂和稀 释液，它还包括结核分枝杆菌特异性抗原、包被的抗INF-Y抗体和载体蛋白偶联 物的酶标二抗；所述结核分枝杆菌特异性抗原为结核分枝杆菌ESAT-6和EIS基 因表达的融合蛋白。所述的抗INF-y抗体为鼠源性IgG抗体。所述的载体蛋白偶联物为碱性磷酸酶，通过戊二醛法交联在酶标二抗体上。 所述的包被的抗ifn- y抗体与载体蛋白的偶联物的载体的物质为聚偏二氯 乙烯。一种权利要求l中所述的结核分枝杆菌特异性抗原的制取方法，它包括如 下的步骤A:以结核分枝杆菌H37Rv基因组序列为模板，通过genebank中报道的ESAT6(GenBank基因文库号AF420491 )和EIS ( GenBank基因文库号AF144099 )基因序列分别设计ESAT-6和EIS基因的扩增引物SEQ NO. 1/SEQ NO. 2和SEQNO. 3/SEQ NO. 4扩增ESAT-6和EIS基因；通过在SEQ NO. 2和SEQ NO. 3中加入互补的碱基作为linker,等量ESAT-6和EIS基因二次扩增后获得融合蛋白基因SEQ NO. 5; 引物序列SEQ NO. 1 5'-CCGGAATTCGATGACAGAGCAGCAGTGG-3';GCCACCGAAGCCTGCGAACATCCCAGTGACGT-3';SEQ NO. 3 5 ，-GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGATCCGGCGGTGGC GGCAGCATGTTCCTACTGGCCGCGGCCAGTTTCA-3' jSEQ NO. 4 5 ，一CCCAAGCTTTAACTCGAACGCGGTCTGGACGGGAA-3 ，SEQ NO.<formula>formula see original document page 7</formula>B:通过在扩增引物中加入对应载体的酶切位点，融合蛋白基因转入表达载体，然后将编码本专利技术的ESAT-6和EIS融合基因可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体，重组表达质粒转入宿主细胞并表达相应融合蛋白，蛋白序列为SEQ NO. 6 (497AA); SEQ NO. 6<formula>formula see original document page 7</formula>C:表达的融合蛋白，通过凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白免疫杂交(westernblotting )进行反应原性分析；表达的融合蛋白采用标准的蛋白分离纯化技术纯化，用亲和层析法获得純化重組结核菌融合蛋白，然后对纯化蛋白进行纯度和内毒素含量分析，作为抗原应用的重组蛋白的纯度要达到98°/。以上，LPS含量小于0. 02 %;D:直接应用eBioscience公司的抗人IFN- y鼠源性IgG;将IgG作为包被 原吸附于以PVDF板作为基质外层包裹的固相凹孔内，并用0. 1。/。小牛血清蛋白的 PBS封闭后完成预包被板的制作。所述的分离纯化重组蛋白方法可用离子交换层析方法或疏水层析方法。 所述的宿主细胞为原核细胞或真核细胞，且与表达质粒相匹配。 所使用的宿主细胞是大肠杆菌BL21-CodonPlus (DE3)-RP。 本专利技术的结核分枝杆菌IFN-y的酶联免疫斑点检测试剂盒通过提供特有的 高特异性和敏感性的重组ESAT-6和EIS融合蛋白为刺激抗原，建立检测结核菌抗原特异性IFN-y的Elispot试剂盒，用于结核菌感染的诊断及疗效判定。本专利技术通过筛选合适的结核菌特异性抗原ESAT-6与EIS组合，制成的重组 融合蛋白舍有二者主要的抗原决定簇。同时本专利技术的重组融合蛋白明确含有适合 不同HLA限制的T细胞表位，不会因为不同人群由于HLA分布不同而影响结果。 通过对不同人群的结核病本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种结核菌感染的酶联免疫斑点诊断试剂盒，它包括试剂盒体、以及设置在盒体中的检验试剂，所述的检验试剂包括阳性标准液、显色剂、浓缩洗涤剂和稀释液，其特征在于它还包括结核分枝杆菌特异性抗原、包被的抗ＩＮＦ－γ抗体和载体蛋白偶联物的酶标二抗；所述结核分枝杆菌特异性抗原为结核分枝杆菌ＥＳＡＴ－６和ＥＩＳ基因表达的融合蛋白。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈心春，周伯平，杨倩婷，张明霞，
申请(专利权)人：深圳市东湖医院，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]
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