分离核酸的方法和试剂盒技术

本发明专利技术涉及从样品去除非靶DNA污染的方法。另外，本发明专利技术涉及对来自宫颈内样品的胎儿DNA的分析。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】分离核酸的方法和试剂盒相关申请的交叉引用本申请根据35U.S.C.§119(e)要求均于2018年1月8日提交的美国专利申请序列号62/614,691和62/614,692的优先权权益。先前申请的公开内容被认为是本申请的一部分，并且通过引用整体并入本申请的公开内容中。
技术介绍

本专利技术总体上涉及用于从含有靶核酸和非靶核酸的宫颈内样品中分离靶核酸的方法和试剂盒，并且更具体地涉及对胎儿核酸的分析。背景信息DNA分离是分子生物学中已确立的方法。在此方法的过程中，细胞以整体被裂解并且DNA与基质结合，或者使用在有机和无机溶剂中不同的溶解度以去除细胞物质，例如蛋白质和干净DNA样品中不需要的其他组分。在某些情况下，外来DNA和/或不需要的DNA(例如，病毒/细菌/无细胞DNA)可与靶细胞共存。这种DNA可以进入或粘附在靶细胞群上，从而干扰基于下游DNA的分析，例如PCR、测序以及全基因组扩增。如果要分析的靶DNA存在于污染性DNA宿主以及目的细胞类型二者中，这特别具有挑战性。这种情况要求靶DNA具有一定量的总分数以便精确分析。在这种情况下，污染性DNA将与靶DNA竞争并掩盖信号，从而使分析从具有挑战性变为不可能。先前在工业上使用的自动化和高通量系统中对细胞核分离的尝试已证明是不成功的。此外，不具有所需的可重复性。当前，没有可用的方法或试剂盒允许使用可用于手动和高通量应用的在DNA基质上分离细胞核的途径来高效去除目的细胞中的污染性DNA(例如核外DNA、母体DNA、微生物DNA、病毒DNA或无细胞DNA)。
技术实现思路
本专利技术基于开创性的发现，即可以从怀孕受试者的宫颈内样品中分离胎儿细胞。本专利技术还包括从含有靶核酸和非靶核酸的宫颈内样品中分离靶核酸(即胎儿核酸)并且随后对靶核酸进行分析。在一个实施方案中，本专利技术提供了一种通过以下方式从包含细胞的样品中分离靶核酸的方法：在DNA结合膜或DNA结合基质上将来自所述样品的细胞与含有至少一种酶的蛋白质混合物一起孵育以释出细胞核；洗涤所述DNA结合膜或所述DNA结合基质以去除非靶核酸；裂解所述细胞核以释放所述靶核酸；并且分离所述靶核酸。在一方面，所述靶核酸是胎儿核酸，并且所述非靶核酸是母体核酸、病毒核酸、微生物核酸或无细胞DNA。在另外的方面，所述细胞是人的。在某些方面，所述细胞是母体细胞和/或胎儿细胞。在一方面，所述样品是宫颈内样品，并且所述宫颈内样品包含母体细胞和胎儿细胞。在某些方面，所述样品包含约1-10个细胞、10-25个细胞、25-50个细胞、50-100个细胞、100-250个细胞、25-500个细胞、500-750个细胞、750-1000个细胞、1000-2500个细胞或2500-5000个细胞。在一方面，所述细胞未固定或未结合至表面(例如DNA结合性或非DNA结合性的膜或基质)。在另外的方面，使用月经杯收集所述宫颈内样品。在进一步的方面，所述蛋白质混合物包含优选消化细胞壁但不消化核被膜的蛋白酶。在某些方面，所述蛋白质混合物包含胃蛋白酶，并且优选地不包含DNA酶。如果选择的采样条件不允许离子自由流入和流出细胞(例如活细胞)，尽管不太好控制，但可以使用低渗溶液从其他细胞物质中释出细胞核。在一方面，在非结合条件下将所述细胞与所述蛋白质混合物孵育。在另一方面，裂解所述细胞核包括将所述细胞与裂解缓冲液一起孵育。在某些方面，所述裂解缓冲液是酶促或非酶促裂解缓冲液。在某些方面，所述裂解缓冲液包含蛋白酶K和/或胰蛋白酶。在另外的方面，所述靶核酸结合至所述DNA结合膜或所述DNA结合基质。在进一步的方面，分离所述靶核酸包括从所述DNA结合膜或所述DNA结合洗脱所述核酸。在一方面，所分离的靶核酸的非靶核酸污染少于约1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或少于约50％。在进一步的方面，通过DNA测序、PCR或全基因组扩增来分析所分离的靶核酸。在另外的实施方案中，本专利技术提供了一种分析来自宫颈内样品的胎儿核酸的方法，所述方法包括从所述宫颈内样品中分离胎儿细胞；在DNA结合膜或DNA结合基质上将所述胎儿细胞与含有至少一种酶的蛋白质混合物一起孵育以释出细胞核；洗涤所述DNA结合膜或所述DNA结合基质以去除非靶核酸；裂解所述细胞核以释放所述胎儿核酸；并且分离所述胎儿核酸。在一方面，使用月经杯收集所述宫颈内样品。在另一方面，宫颈内样品包含母体细胞和胎儿细胞。在另外的方面，分离所述胎儿细胞包括使所述胎儿细胞与抗HLA抗体结合。在某些方面，所述样品包含约1-10个细胞、10-25个细胞、25-50个细胞、50-100个细胞、100-250个细胞、25-500个细胞、500-750个细胞、750-1000个细胞、1000-2500个细胞或2500-5000个细胞。在一方面，所述细胞未固定或未结合至表面(即DNA结合性或非DNA结合性的膜或基质)。在进一步的方面，所述蛋白质混合物包含优选消化细胞壁但不消化核被膜的蛋白酶。在某些方面，所述蛋白质混合物包含胃蛋白酶，并且优选地不包含DNA酶。在一方面，裂解所述细胞核包括将所述细胞与裂解缓冲液一起孵育。在某些方面，所述裂解缓冲液是酶促或非酶促裂解缓冲液。在某些方面，所述裂解缓冲液包含蛋白酶K和/或胰蛋白酶。在另一方面，所释放的胎儿核酸结合至所述DNA结合膜或所述DNA结合基质。在另外的方面，分离所述胎儿核酸包括从所述DNA结合膜或所述DNA结合基质洗脱所述核酸。在某些方面，所述胎儿核酸的非靶核酸污染少于约1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或少于约50％。在进一步的方面，通过DNA测序、PCR或全基因组扩增来分析所分离的胎儿核酸。在一方面，分析所述胎儿核酸包括鉴定遗传异常或基于基因的疾病；基因突变；或染色体异常。在另外的方面，分析所述胎儿核酸包括鉴定由遗传异常、基因突变或染色体异常引起的疾病或病症，所述疾病或病症是软骨发育不全、唐氏综合征、21三体、18三体、13三体、特纳综合征、镰状细胞疾病、囊性纤维化、脆性XD综合征、肌营养不良、泰-萨二氏病、脊柱裂、无脑畸形、地中海贫血、多囊性肾病、血友病A、亨廷顿病或先天性肾上腺增生症。在进一步的实施方案中，本专利技术提供了一种用于收集宫颈内样品的试剂盒，所述试剂盒包括可折叠的月经杯；储存容器；以及运输介质。在一方面，将所述月经杯插入阴道腔中。在另一方面，将所述月经杯插入一段时间并在允许样品收集的条件下插入例如约10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟、少于一小时、1-2小时、1-5小时、1-10小时、1-20或更多小时。在另外的方面，所述运输介质包含至少一种细胞保存化学品。在进一步的方面，所述保存化学品是甘油、血清、二甲亚砜、甲醇、乙酸、细胞培养基、干燥剂或其组合。附图说明图1A-1D示出了BAF图，指示细胞核纯化改善了胎儿DNA质量。BAF频率(B等位基因频率)图示出了高度可变单核苷酸多态性的基因型的比较(在有或没有细胞核分离的情况下，胎儿细胞与胎儿本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从细胞样品中分离靶核酸的方法，其包括：/na)在DNA结合膜或DNA结合基质上将所述细胞与含有至少一种酶的蛋白质混合物一起孵育以释出细胞核；/nb)洗涤所述DNA结合膜或所述DNA结合基质以去除非靶核酸；/nc)裂解所述细胞核以释放所述靶核酸；并且/nd)分离所述靶核酸。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180108 US 62/614,691;20180108 US 62/614,6921.一种从细胞样品中分离靶核酸的方法，其包括：
a)在DNA结合膜或DNA结合基质上将所述细胞与含有至少一种酶的蛋白质混合物一起孵育以释出细胞核；
b)洗涤所述DNA结合膜或所述DNA结合基质以去除非靶核酸；
c)裂解所述细胞核以释放所述靶核酸；并且
d)分离所述靶核酸。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸是胎儿核酸。


3.根据权利要求1所述的方法，其中非靶核酸是母体核酸、病毒核酸、微生物核酸、无细胞DNA或其组合。


4.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是人的。


5.根据权利要求4所述的方法，其中所述细胞是母体细胞和/或胎儿细胞。


6.根据权利要求1所述的方法，其中样品是宫颈内样品。


7.根据权利要求6所述的方法，其中所述宫颈内样品包含非靶核酸、母体细胞以及胎儿细胞。


8.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品包含约1-10个细胞、10-25个细胞、25-50个细胞、50-100个细胞、100-250个细胞、25-500个细胞、500-750个细胞、750-1000个细胞、1000-2500个细胞或2500-5000个细胞。


9.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质混合物包含消化细胞壁的蛋白酶。


10.根据权利要求9所述的方法，其中所述蛋白酶是胃蛋白酶。


11.根据权利要求1所述的方法，其中在非DNA结合条件下将所述细胞与所述蛋白质混合物一起孵育。


12.根据权利要求1所述的方法，其中裂解所述细胞核包括将所述细胞与裂解缓冲液一起孵育。


13.根据权利要求12所述的方法，其中所述裂解缓冲液可以是酶促的或非酶促的。


14.根据权利要求12所述的方法，其中所述裂解缓冲液包含蛋白酶K和/或胰蛋白酶。


15.根据权利要求1所述的方法，其中靶核酸结合至所述DNA结合膜或所述DNA结合基质。


16.根据权利要求1所述的方法，其中分离所述靶核酸包括从所述DNA结合膜或所述DNA结合基质洗脱所述核酸。


17.根据权利要求1所述的方法，其中所分离的靶核酸的非靶核酸污染少于约1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或少于约50％。


18.根据权利要求1所述的方法，其还包括通过DNA测序、PCR或全基因组扩增对所分离的靶核酸进行分析。


19.一种分析来自宫颈内样品的胎儿核酸的方法，其包括：
a)从所述宫颈内样品中分离胎儿细胞；
b)在DNA结合膜或DNA结合基质上将所述胎儿细胞与蛋白质混合物一起孵育以释出细胞核；
c)洗涤所述DNA结合膜或所述DNA结合基质以去除非靶核酸；
d)裂解所述细胞核以释放所述胎儿核酸；并且
e)分...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·德雷洛，
申请(专利权)人：摇篮基因组公司，
类型：发明
国别省市：美国;US