一种产琼胶酶菌株的选育方法技术

本发明专利技术属于产琼胶酶菌株选育领域，尤其是一种产琼胶酶菌株的选育方法，针对现有的产琼胶酶菌株在琼脂平板上会形成凹陷，同时培养基中的有机营养物含量高，蛋白胨为1％，酵母粉为0.5％，无法纯化产琼胶酶菌株的问题，现提出如下方案，其包括以下步骤：S1：制备三种分离培养基，三种分离培养基分别为I型培养基、II型培养基、III型培养基，S2：挑取凹陷中的菌落与1毫升无菌水，混匀，作为种子液；S3：将种子液梯度稀释，稀释成三种浓度的种子液，然后将三种浓度的种子液涂布于三种分离培养基上，本发明专利技术所用培养基为寡营养培养基，有机营养物含量低，能够顺利纯化产琼胶酶菌株，同时能够精准控制人工海水加入量。

【技术实现步骤摘要】
一种产琼胶酶菌株的选育方法
本专利技术涉及产琼胶酶菌株选育
，尤其涉及一种产琼胶酶菌株的选育方法。
技术介绍
琼胶是一种亲水性的红藻多糖，琼胶酶能够水解琼胶多糖，因此琼胶酶在红藻的单细胞分离、酶解破壁制备原生质体等过程中具有重要的价值，是海藻遗传工程的工具酶。现有技术中，产琼胶酶菌株在琼脂平板上会形成凹陷，同时培养基中的有机营养物含量高，蛋白胨为1％，酵母粉为0.5％，无法纯化产琼胶酶菌株，因此我们提出了一种产琼胶酶菌株的选育方法，用来解决上述问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术中存在产琼胶酶菌株在琼脂平板上会形成凹陷，同时培养基中的有机营养物含量高，蛋白胨为1％，酵母粉为0.5％，无法纯化产琼胶酶菌株的缺点，而提出的一种产琼胶酶菌株的选育方法。为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：一种产琼胶酶菌株的选育方法，包括以下步骤：S1：制备三种分离培养基，三种分离培养基分别为I型培养基、II型培养基、III型培养基，S2：挑取凹陷中的菌落与1毫升无菌水，混匀，作为种子液；S3：将种子液梯度稀释，稀释成三种浓度的种子液，然后将三种浓度的种子液涂布于三种分离培养基上，挑单菌落划线，没能获得纯种的产琼胶酶菌株；S4：在制备种子液时添加表面活性剂Tween20，表面活性剂Tween20的浓度为3％-6％，将种子液涂布于三种分离培养基上，挑单菌落划线，仍然没能获得纯种的产琼胶酶菌株；S5：挑单菌落于I型培养基和II型培养基，分别在15℃，28℃，37℃，45℃的温度条件下培养；S6：12-24h后，仅在28℃的I型培养基长出了产琼胶酶的菌株，挑单菌落培养1-2d后，煮沸法提取基因组DNA，并依此为模板PCR扩增16SrRNA基因片段，与克隆载体连接后，转化大肠杆菌；送测序公司进行测序；测序成功，获得纯种的产琼胶酶菌株，序列比对结果为：与产琼胶酶菌种Agarivoranslitoreus的16SrRNA基因序列相似性为99.05％。优选的，所述S1中，称量蛋白胨3-5g，琼脂10-20g，加Na+人工海水补至1L，即可制得I型培养基。优选的，所述S1中，称量琼脂10-20g，加Na+人工海水补至1L，即可制得II型培养基。优选的，所述S1中，称量蛋白胨1-2g，琼脂10-20g，加Na+人工海水补至1L，即可制得III型培养基。优选的，所述S3中，三种浓度的种子液的浓度分别为：10-1、10-2、10-3。优选的，所述S4中，在制备种子液时添加表面活性剂Tween20，表面活性剂Tween20的浓度为6％，将种子液涂布于三种分离培养基上，挑单菌落划线，仍然没能获得纯种的产琼胶酶菌株。优选的，所述S6中，24h后，仅在28℃的I型培养基长出了产琼胶酶的菌株，挑单菌落培养2d后，煮沸法提取基因组DNA，并依此为模板PCR扩增16SrRNA基因片段，与克隆载体连接后，转化大肠杆菌；送测序公司进行测序；测序成功，获得纯种的产琼胶酶菌株，序列比对结果为：与产琼胶酶菌种Agarivoranslitoreus的16SrRNA基因序列相似性为99.05％。优选的，在加Na+人工海水时，首先将蛋白胨和琼脂放进水箱内，然后在水箱内设一个浮板，浮板上固定安装一个浮杆，浮杆的顶部固定安装一个对射型光电传感器，在水箱的顶部再安装一个对射型关电传感器，两个对射型光电传感器连上同一个控制器，当水箱内的溶液到达1L时，此时两个对射型光电传感器正好连通，给控制发送信号，控制器接收到信号关闭电磁阀，停止人工海水的加入，精准控制人工海水加入量。本专利技术中，所述一种产琼胶酶菌株的选育方法所用培养基为寡营养培养基，有机营养物含量低，蛋白胨为0.5％，酵母粉为0％，在这种寡营养配养基上顺利纯化了产琼胶酶菌株，同时能够精准控制人工海水加入量，本专利技术所用培养基为寡营养培养基，有机营养物含量低，能够顺利纯化产琼胶酶菌株，同时能够精准控制人工海水加入量。具体实施方式下面对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。实施例一一种产琼胶酶菌株的选育方法，包括以下步骤：S1：制备三种分离培养基，三种分离培养基分别为I型培养基、II型培养基、III型培养基，S2：挑取凹陷中的菌落与1毫升无菌水，混匀，作为种子液；S3：将种子液梯度稀释，稀释成三种浓度的种子液，然后将三种浓度的种子液涂布于三种分离培养基上，挑单菌落划线，没能获得纯种的产琼胶酶菌株；S4：在制备种子液时添加表面活性剂Tween20，表面活性剂Tween20的浓度为3％，将种子液涂布于三种分离培养基上，挑单菌落划线，仍然没能获得纯种的产琼胶酶菌株；S5：挑单菌落于I型培养基和II型培养基，分别在15℃，28℃，37℃，45℃的温度条件下培养；S6：12h后，仅在28℃的I型培养基长出了产琼胶酶的菌株，挑单菌落培养1d后，煮沸法提取基因组DNA，并依此为模板PCR扩增16SrRNA基因片段，与克隆载体连接后，转化大肠杆菌；送测序公司进行测序；测序成功，获得纯种的产琼胶酶菌株，序列比对结果为：与产琼胶酶菌种Agarivoranslitoreus的16SrRNA基因序列相似性为99.05％。本实施例中，称量蛋白胨3g，琼脂10g，加Na+人工海水补至1L，即可制得I型培养基；S1中，称量琼脂10g，加Na+人工海水补至1L，即可制得II型培养基；S1中，称量蛋白胨1g，琼脂10g，加Na+人工海水补至1L，即可制得III型培养基。实施例二一种产琼胶酶菌株的选育方法，包括以下步骤：S1：制备三种分离培养基，三种分离培养基分别为I型培养基、II型培养基、III型培养基，S2：挑取凹陷中的菌落与1毫升无菌水，混匀，作为种子液；S3：将种子液梯度稀释，稀释成三种浓度的种子液，然后将三种浓度的种子液涂布于三种分离培养基上，挑单菌落划线，没能获得纯种的产琼胶酶菌株；S4：在制备种子液时添加表面活性剂Tween20，表面活性剂Tween20的浓度为4％，将种子液涂布于三种分离培养基上，挑单菌落划线，仍然没能获得纯种的产琼胶酶菌株；S5：挑单菌落于I型培养基和II型培养基，分别在15℃，28℃，37℃，45℃的温度条件下培养；S6：18h后，仅在28℃的I型培养基长出了产琼胶酶的菌株，挑单菌落培养1.5d后，煮沸法提取基因组DNA，并依此为模板PCR扩增16SrRNA基因片段，与克隆载体连接后，转化大肠杆菌；送测序公司进行测序；测序成功，获得纯种的产琼胶酶菌株，序列比对结果为：与产琼胶酶菌种Agarivoranslitoreus的16SrRNA基因序列相似性为99.05％。本实施例中，称量蛋白胨4g，琼脂15g，加Na+人工海水补至1L，即可制得I型培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产琼胶酶菌株的选育方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1：制备三种分离培养基，三种分离培养基分别为I型培养基、II型培养基、III型培养基，/nS2：挑取凹陷中的菌落与1毫升无菌水，混匀，作为种子液；/nS3：将种子液梯度稀释，稀释成三种浓度的种子液，然后将三种浓度的种子液涂布于三种分离培养基上，挑单菌落划线，没能获得纯种的产琼胶酶菌株；/nS4：在制备种子液时添加表面活性剂Tween20，表面活性剂Tween20的浓度为3％-6％，将种子液涂布于三种分离培养基上，挑单菌落划线，仍然没能获得纯种的产琼胶酶菌株；/nS5：挑单菌落于I型培养基和II型培养基，分别在15℃，28℃，37℃，45℃的温度条件下培养；/nS6：12-24h后，仅在28℃的I型培养基长出了产琼胶酶的菌株，挑单菌落培养1-2d后，煮沸法提取基因组DNA，并依此为模板PCR扩增16S rRNA基因片段，与克隆载体连接后，转化大肠杆菌；送测序公司进行测序；测序成功，获得纯种的产琼胶酶菌株，序列比对结果为：与产琼胶酶菌种Agarivorans litoreus的16S rRNA基因序列相似性为99.05％。/n

【技术特征摘要】
1.一种产琼胶酶菌株的选育方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：制备三种分离培养基，三种分离培养基分别为I型培养基、II型培养基、III型培养基，
S2：挑取凹陷中的菌落与1毫升无菌水，混匀，作为种子液；
S3：将种子液梯度稀释，稀释成三种浓度的种子液，然后将三种浓度的种子液涂布于三种分离培养基上，挑单菌落划线，没能获得纯种的产琼胶酶菌株；
S4：在制备种子液时添加表面活性剂Tween20，表面活性剂Tween20的浓度为3％-6％，将种子液涂布于三种分离培养基上，挑单菌落划线，仍然没能获得纯种的产琼胶酶菌株；
S5：挑单菌落于I型培养基和II型培养基，分别在15℃，28℃，37℃，45℃的温度条件下培养；
S6：12-24h后，仅在28℃的I型培养基长出了产琼胶酶的菌株，挑单菌落培养1-2d后，煮沸法提取基因组DNA，并依此为模板PCR扩增16SrRNA基因片段，与克隆载体连接后，转化大肠杆菌；送测序公司进行测序；测序成功，获得纯种的产琼胶酶菌株，序列比对结果为：与产琼胶酶菌种Agarivoranslitoreus的16SrRNA基因序列相似性为99.05％。


2.根据权利要求1所述的一种产琼胶酶菌株的选育方法，其特征在于，所述S1中，称量蛋白胨3-5g，琼脂10-20g，加Na+人工海水补至1L，即可制得I型培养基。


3.根据权利要求1所述的一种产琼胶酶菌株的选育方法，其特征在于，所述S1中，称量琼脂10-20g，加Na+人工海水补至1L，即可制得II型培养基。


4.根据权利要求1所述的一种产琼胶酶菌株的选...

【专利技术属性】
技术研发人员：王燕，崔彩霞，张玉阳，刘婷威，张瑶，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：河南;41