内皮素转化酶(ECE)制造技术

一种内皮素转化酶，包括ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０或ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３６所示的多肽序列或其功能性片段。２．编码如权利要求１所要求的内皮素转化酶的ＤＮＡ序列，选自下列的一组序列：ａ）具有ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２９或ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３５所述结构的ＤＮＡ序列；ｂ）编码具有ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０或ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３６所述结构之蛋白质的ＤＮＡ序列；以及ｃ）在标准条件下与ＤＮＡ序列ａ）或ｂ）杂交的ＤＮＡ序列；ｄ）编码能被针对ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０或３６之蛋白质或其片段所产生的抗体识别的蛋白质产物之ＤＮＡ序列。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及内皮素转化酶、该酶的制备方法及其应用。内皮素水平升高被认为与原发性高血压、心肌梗塞、急性肾功能衰竭、休克或心功能衰竭等多种疾病有关。利用内皮素抗体所能获得的结果也提示了这种相关性。在动物模型中，有可能以此以剂量依赖性方式减少心肌梗塞的面积(Watanabeet al.，Nature 344，114(1990)、对肾功能产生有益的影响(Kon et al.，J.Clin.Invest.83，1762(1989))和降低环孢菌素的肾毒性(Kon et al.，KindeyInt.37，1487(1990))。内皮素转化酶(ECE-1)可从由38个氨基酸组成的前体分子之大内皮素1释出内皮素1。由内皮素1所引起的不利生物作用可通过例如抑制内皮素转化酶，进而抑制内皮素1的生物合成来加以阻止。已从多种细胞系中分离出由相应的前体分子，即大内皮素释放内皮素或内皮素样分子的酶活性(Takeda et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.176，860(1991)，Ohnaka et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.168，1128(1990)；Matsumura et al.，FEBS Lett.293，45(1992)，Ahn et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，8606(1992)，PCTWO 92/13944，Ohnaka et al.Clin.Exp.Hypertension A 14；No.4(1992)，Okada et al.Biochem.Biophys.Res.Comm.180，1019(1991)，Takada et al.Biochem.Biophys.Res.Comm.182，1383(1992)，Opgenorth et al.FASEB 6，2653(1992))然而，这些酶活性的特征至今还未得以充分地鉴定。该酶以未被浓缩的酶混合物形式存在。但是，这些类型的不纯酶混合物不是非常适用于发现特异性ECE抑制剂的测定法，因为具有非生理相关性的外源蛋白酶极大地干扰了酶测定。因此，大内皮素也可以由例如丝氨酸蛋白酶胰凝乳蛋白酶以及木瓜蛋白酶、嗜热菌蛋白酶和NEP 24.11裂解成内皮素和内皮素样产物，而这些酶在测定法中被错误地定为ECE酶。结果，与文献中有关内皮素转化酶的描述产生矛盾。有关内皮素转化酶的分子量的描述是在65-540KD范围内变动；Km和Vmax值也彼此极不相同(Opgenorth et al.，FASEB 6，2653(1992)；Sawamuraet al.Biochem.Biophys.Acta 1161，295(1993))。在是否将内皮素转化酶定为天冬氨酸蛋白酶族或金属蛋白酶族方面也存在着分歧(Sawamura etal.Biochem.Biophys.Acta 1161，295(1993)；Biochem.Pharmacol.43，845(1992)。而且，有关金属蛋白酶是否为胞质酶或膜结合酶和哪些底物可被特定的ECE(大Et-1；大Et-3)转化之特征信息的对立意见可见于下列文献Matsumura et al.(FEBS Lett.293，45(1992)Takahashi et al.(J.Biol.Chem.268；21394(1993))；Okada et al.(Biochem.Biophys.Res.Comm.180，1019(1991))；Ohnaka et al.(Clin.Exp.Hypretension A14；No.4(1992))；Matsumura et al.(FEBS Lett.305；86(1992))。至今还未见能够使得满意地定义ECE的确定性描述。大概只有通过测定ECE的一级结构其氨基酸序列才可能定义ECE。为此，首先必需制备纯化形式的ECE。本专利技术的目的在于制备纯化形式的内皮素转化酶。我们已经发现，通过分子量为250,000Da的内皮素转化酶和其部分氨基酸序列SEQ ID NO1可以实现上述目的。本专利技术的内皮素转化酶具有下列特征在非还原条件下经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的分子量约为250,000Da；在还原条件下的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示出大约125,000Da的条带，推测其由同源二聚体组成。内皮素转化酶是糖基化酶。经酶学方法除去糖基使表观分子量由125,000Da变为大约82,000Da。内皮素转化酶的胰蛋白酶肽的测序提供了下文的部分氨基酸序列SEQ IDNO1、2、3、4、5、6。本专利技术内皮素转化酶的更进一步特征将在实施中描述。本专利技术进一步涉及分子量约为250,000Da且与SEQ ID NO1显示出至少80％同源性之部分氨基酸序列的内皮素转化酶。所述内皮素转化酶可从牛之外的生物体，例如从人细胞中分离。本专利技术进一步涉及含有SEQ ID NO30和SEQ ID NO36所述多肽序列的内皮素转化酶或其功能性片段。功能性片段意指仍然具有内皮素转化酶之酶活性、抗原特性或与配体(如结合蛋白质)的亲和力的那些部分序列。其它的功能性片段包括可从SEQ ID NO30或NO36开始经氨基酸或肽的插入、缺失或替代能够得到片段，并且仍然基本具有内皮素转化酶的酶活性和/或基本具有与SEQ ID NO30或NO36的内皮素转化酶的免疫交叉反应性。本专利技术进一步涉及编码内皮素转化酶且选自下组序列的DNA序列a)具有SEQ ID NO29或SEQ ID NO35所述结构的DNA序列；b)编码具有SEQ ID NO30或SEQ ID NO36所述结构之蛋白质的DNA序列；以及c)在标准条件下与DNA序列a)或b)杂交的DNA序列；d)编码能被针对SEQ ID NO30或36之蛋白质产生的抗体所识别的蛋白质产物或其片段的DNA序列。标准条件指例如在浓度为0.1－1×SSC(1×SSC0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH 7.2)的水性缓冲液中温度为42-58℃。DNA杂交的实验条件在遗传工程的教科书(如Sambrook et al.，“Molecular Cloning”Cold SpringHarbor Laboratory，1989)中进行了描述。实施例8描述了所说DNA序列的制备。所说的DNA序列的蛋白质产物可以被已产生的SEQ ID NO30或36的蛋白质或其片段之抗体识别，从而以已很好描述的方法获得。在例如Hudson和Hay，F.C.，“Practical Immunology”，Blackwell Sci.Pub.，Oxford，1980书中描述了培育所说蛋白质抗体的方法。在例如“DNA Clonging Vol.I”，Glover，D.M.，Ed.，IRL PressOxford，1985的书中描述了用抗体发现编码与这些抗体发生交叉反应的蛋白质之cDNA序列的方法。本专利技术进一步涉及内皮素转化酶制备的方法，它包括用内皮素转化酶抑制剂刺激哺乳动物细胞，优选内皮细胞，使之过量产生内皮素转化酶，然后用常规蛋白质化学方法从这些细胞中分离内皮素转化酶。所有的ECE抑制剂均可用于诱导哺乳动物细胞ECE。在下列的文献中描述了用于此目的的ECE抑制本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：B克勒格，H索尔堡格，T迈耶，M施米特，E雅各布，R奥特，T苏考斯基，H希伦，
申请(专利权)人：BASF公司，
类型：发明
国别省市：