低密度脂蛋白中胆甾醇的定量法及其试剂盒制造技术

一种ＬＤＬ中胆甾醇的定量法，其特征在于，从含有低密度脂蛋白（ＬＤＬ）的试样中除去高密度脂蛋白（ＨＤＬ）中的胆甾醇之后，使胆甾醇酯水解酶和胆甾醇氧化酶或胆甾醇氧化还原酶与其反应，定量分析由此产生的过氧化氢或还原型辅酶。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种在临床诊断领域中对动脉硬化的诊断具有重要意义的低密度脂蛋白(LDL)中的胆甾醇(以下称为LDL胆甾醇)的定量法。迄今为止，在进行LDL胆甾醇的定量时，都是首先测定试样中的胆甾醇总量，然后向另外一个试样中添加LDL和极低密度脂蛋白(VLDL)的沉淀剂，离心分离，测定上清液中高密度脂蛋白(HDL)中的胆甾醇(以下称为HDL胆甾醇)含量，再根据Friedewald的换算式算出其数值(日本临床广范围血液·尿化学检查免疫学的检查上卷，日本临床社出版，615页，1995年)。按照该方法，必须对总胆甾醇含量和HDL胆甾醇含量分二次测定，另外还需进行离心分离操作等，步骤麻烦。然而，即使单纯地将血清试样直接添加到含有胆甾醇酯酶和胆甾醇氧化酶的试剂中，与测定胆甾醇总量的体系没有差别，对LDL胆甾醇没有特异性。在特开昭58-165800中公开了一种在特殊的表面活性剂的存在下，不需分离操作即可直接测定LDL胆甾醇含量的方法。然而，按照该方法，在LDL胆甾醇发生反应的同时，HDL胆甾醇也发生反应，LDL的特异性低，而且，该反应条件的设定麻烦，难以适用于多种多样的试样。另外，在特开平7-280812中公开了这样一种方法，该方法是先使LDL凝聚，然后除去LDL以外的脂蛋白中的胆甾醇，再将已凝聚的LDL进行解凝聚，通过使LDL胆甾醇进行酶反应来测定LDL胆甾醇的含量。本专利技术者们研究出下述a)、b)两种方法，从而完成了本专利技术，其中a)在一种能阻断HDL以外的脂蛋白即LDL、VLDL和乳糜微粒(CM)反应的试剂的存在下，使用一种胆甾醇反应试剂与HDL胆甾醇进行特异反应而将其除去，然后根据需要，在一种可使与LDL胆甾醇反应可能化的试剂的存在下，用一种胆甾醇反应试剂，使胆甾醇进行定量的酶反应，这样不需特地进行分离即能特异地定量含有LDL的试样中的LDL胆甾醇；b)仅仅对LDL进行反应阻断，在用一种胆甾醇反应试剂将LDL以外的脂蛋白中的胆甾醇通过反应除去后，再用一种胆甾醇反应试剂使胆甾醇进行定量的酶反应，这样不需特地进行分离即能特异地定量含有LDL的试样中的LDL胆甾醇。此处，所谓对HDL以外的脂蛋白进行反应阻断是指，使HDL以外的脂蛋白凝聚，或者使HDL以外的脂蛋白外壁的反应性减弱，从而仅仅使这些脂蛋白的外壁选择性地不被破坏，这样就可使HDL中的胆甾醇成为能选择性地进行酶反应的状态。另外，所谓将LDL胆甾醇反应可能化是指，通过使LDL的外壁破坏来使LDL胆甾醇成为能够进行酶反应的状态。另外，所谓仅仅对LDL进行反应阻断是指，相反地使LDL凝聚或者使LDL的外壁的反应性减弱，从而使得仅仅是LDL的外壁选择性地不被破坏，这样就可使LDL以外的脂蛋白中的胆甾醇成为能够选择性地进行酶反应的状态。本专利技术涉及一种LDL胆甾醇的定量法，其特征在于，从含有LDL的试样中除去HDL胆甾醇，然后根据需要，在一种可使LDL胆甾醇反应可能化的试剂的存在下，使其与胆甾醇酯水解酶和胆甾醇氧化酶或胆甾醇氧化还原酶反应，然后定量由此产生的过氧化氢或还原型辅酶。另外，根据本专利技术，可以提供一种用于LDL中的胆甾醇定量的试剂，该试剂以能够对HDL以外的脂蛋白进行反应阻断的试剂和能使LDL中的胆甾醇反应可能化的试剂作为组成成分，或者可以提供一种用于LDL中的胆甾醇定量的试剂，该试剂由能够对HDL以外的脂蛋白进行反应阻断的试剂和能使LDL中的胆甾醇反应可能化的试剂组合而成。另外，根据本专利技术，还可以提供一种以仅仅对LDL进行反应阻断的试剂作为成分的用于LDL中的胆甾醇定量的试剂，一种以仅仅对LDL进行反应阻断的试剂和可使LDL中的胆甾醇反应可能化的试剂作为成分的用于LDL中的胆甾醇定量的试剂，或者一种由仅仅对LDL进行反应阻断的试剂与可使LDL中的胆甾醇反应可能化的试剂组合而成的用于LDL中的胆甾醇定量的试剂。作为上述定量法之一，可以举出在一种能对HDL以外的脂蛋白，即LDL、VLDL和CM进行反应阻断的试剂的存在下，用一种胆甾醇反应试剂使HDL胆甾醇发生特异反应而将其除去后，根据需要，在一种可使LDL胆甾醇反应可能化的试剂的存在下，使其与胆甾醇酯水解酶和胆甾醇氧化酶或胆甾醇氧化还原酶反应，然后定量分析所产生的过氧化氢或还原型辅酶的方法；另外，作为另一种方法，可以举出在一种仅仅对LDL进行反应阻断的试剂的存在下，用一种胆甾醇反应试剂将LDL以外的脂蛋白中的胆甾醇除去之后，使其与胆甾醇酯水解酶和胆甾醇氧化酶或胆甾醇氧化还原酶反应，然后定量分析由此产生的过氧化氢或还原型辅酶的方法。例如，在一种能对HDL以外的脂蛋白进行反应阻断的试剂的存在下，使含有HDL和LDL的试样与胆甾醇酯水解酶和胆甾醇氧化酶反应而生成过氧化氢，在此之后或者同时，向其中加入过氧化氢酶、过氧化物酶与苯胺化合物、过氧化物酶与苯酚化合物或者过氧化物酶与4-氨基安替比林，以除去过氧化氢，然后加入色素源(在使用过氧化氢酶的情况下也添加过氧化物酶)和适当的表面活性剂、环糊精类、或者能与LDL作用的胆甾醇酯水解酶以使其发色，从而能对LDL胆甾醇进行定量。此处，所谓能与LDL作用是指，通过破坏已被阻断反应的LDL的外壁，使LDL胆甾醇成为能进行酶反应的状态。另外，在一种仅对LDL进行反应阻断的试剂的存在下，向含有LDL的试样中加入胆甾醇酯水解酶和胆甾醇氧化酶和色素源以使其发色，这时，通过测定在LDL以外的脂蛋白中的胆甾醇发生反应之后的吸光度的变化，即可以对LDL胆甾醇进行定量。另外，在一种仅对LDL进行反应阻断的试剂(在下述的胆甾醇酯水解酶能仅对LDL进行反应阻断的情况下则不需要)的存在下，使含有LDL的试样与胆甾醇酯水解酶和胆甾醇氧化酶作用而生成过氧化氢，在此之后或同时，向其中加入过氧化氢酶、过氧化物酶与苯胺化合物、过氧化物酶与苯酚化合物或者过氧化物酶与4-氨基安替比林，以除去过氧化氢，然后向其中加入色素源(在使用过氧化氢酶的场合也添加过氧化物酶)和能使LDL胆甾醇反应可能化的试剂(在下述的胆甾醇酯水解酶能使LDL胆甾醇反应可能化的情况下则不需要)、胆甾醇水解酶(由于在最初加入的胆甾醇酯水解酶是能使LDL胆甾醇反应可能化的试剂，因此在能够与LDL胆甾醇反应的情况下就不需要)以使其发色，这时即可对LDL胆甾醇进行定量。本专利技术的方法适用于血液、尿等含有LDL的体液。下面对本专利技术的定量法举例进行说明。例1①向规定量的试样中加入一种含有能对HDL以外的脂蛋白进行反应阻断的试剂的中性附近的缓冲液，例如在37℃下加温数分钟以使LDL、VLDL和CM发后反应阻断；②向其中加入一种与LDL没有反应性的胆甾醇酯水解酶(优选是经化学修饰的胆甾醇酯水解酯)、一种与LDL没有反应性的胆甾醇氧化酶(优选是经化学修饰的胆甾醇氧化酶)〔或者胆甾醇氧化还原酶(优选是经化学修饰的胆甾醇氧化还原酶)〕以及过氧化氢酶、过氧化物酶与苯胺化合物、过氧化物酶与苯酚化合物或过氧化物酶与4-氨基安替比林〔或NAD(P)〕，以使HDL胆甾醇反应而将其除去；③加入表面活性剂、环糊精类、螯合剂、能与LDL反应的胆甾醇酯水解酶(优选是未经化学修饰的胆甾醇脂水解酶)、能与LDL反应的胆甾醇氧化酶(优选是未经化学修饰的胆甾醇氧化酶)或能与LDL反应的胆本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：宫内一人，三池彰，
申请(专利权)人：协和梅迪克斯株式会社，
类型：发明
国别省市：