治疗对治疗有抗性的肿瘤的方法技术

本发明专利技术提供一种选择性抑制病理细胞的方法，其中所述细胞特征在于表达一种内源胞内激活酶，并且其中所述酶不被底物前体药物化合物灭活。该方法要求使细胞接触有效量的底物化合物从而选择性抑制病理细胞的增殖。本发明专利技术还提供了筛选通过酶在细胞内选择性将前体药物转化为毒素的前体药物的方法，该方法包括使至少两种表达内源胞内酶的试验细胞与来自相同或不同物种的候选前体药物接触并且测定通过内源胞内酶将前体药物激活为毒素物质的激活作用。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及癌症治疗领域，更具体地说，涉及治疗对治疗有抗性的肿瘤的组合物和方法。
技术介绍
该公开文本自始至终，通过第一作者和日期，专利号或公开号引用参考各文献。该说明书中可以看到各参考文献的总文献目录。这些出版物的公开内容被引入本公开文本中作为参考以更详细地描述本专利技术所涉及的本领域的状况。癌症对化学治疗的抗性是一个主要的健康护理问题。抗性机理可以分作两种类型内源性的和获得性的。对于癌症，大多数抗药性是酶介导的。或者是靶酶对化学治疗以太高的水平表达，从而不能阻断其活性同时没有对宿主的不可接受的毒性；或者酶被快速改变化学治疗的染病细胞表达，从而破坏其治疗活性。当染病细胞丧失肿瘤抑制剂基因功能(p53，RB，p16)时，癌症发生对化学治疗的内源性抗性。当该内源性抗性发生时，细胞周期自始至终组成性地表达酶，例如胸苷酸合成酶(TS)和二氢叶酸还原酶(DHFR)(Yeager和Reznikoff(1998)J.Urol.(159)(2)581-5；el-Deiry(1997)Curr.Opin.Oncol.9(1)79-87；Goker，Waltham，等(1995)血液(Blood)86(2)677-84；Banerjee，Ercikan-Abali等(1995)ActaBiochem Pol42(4)457-64；Fan和Bertino(1997)癌症基因(Oncogene)14(10)1191-1200；Slansky和Farnham(1996)生物测试(Bioassay)18(1)55-62；Lenz，Danenberg等(1998)临床癌症研究(Clin.CancerRes.)4(5)1227-34；和Lee等(1997)表达细胞研究(Exp.CellRes.)234(2)270-6)。这导致对氟代嘧啶(通过提高TS的表达)或对甲氨蝶呤(通过提高水平的DHER的表达)的内源性抗性的增加。最新治疗的发展大部分限制在开发更好的酶抑制剂，或者对要抑制的新的酶的研究(Hu等(1998)药物科学杂志(J.Pharm.Sci.)87(7)886-90；Drake等(1996)生化药理学(Biochem.Pharmacol)51(10)1349-55；Schultz等(1999)抗癌研究(Anticancer Res.)19(1A)437-43；Touroutoglou和Pazdur(1996)临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)2(2)227-43；和Handfield和Levesque(1999)FEMS微生物研究(FEMSMicrobiol.Rev.)23(1)69-91)。申请人发现了很好地定向表征的酶的治疗的新途径。该项技术与先前的和历史上的对癌症治疗的途径不同，并且称之为“ECTA”，即酶催化的治疗性激活。本专利技术的公开本专利技术提供选择性抑制病理肿瘤细胞的方法，特征在于表达内源性的细胞内激活酶。该方法要求使细胞接触有效量的底物化合物从而选择性抑制细胞的增殖。该底物前体药物化合物不灭活该酶。本专利技术还提供抑制通过使至少两种表达内源性的细胞内酶的试验细胞接触候选前体药物而被内源性的细胞内酶在细胞内选择性转化为毒素的前体药物的筛选方法和内源性的细胞内酶将前体药物激活成毒素物质的测定方法。附图简要描述附图说明图1图示说明本专利技术的ECTA前体药物的作用机理。图2是说明从溴乙基2’-脱氧尿苷一磷酸(“BVdUMP”)与重组人胸苷酸合成酶(“rHuTS”)培养得到的荧光产物的图。BVdUMP与胸苷酸合成酶(“TS”)的温育导致荧光产物的时间和酶依赖性产生。BVdUMP与指定量的rHuTS在标准反应混合物中在30℃下温育(材料和方法)，但是从反应中省去了N5，N10-亚甲基四氢叶酸。与各数据曲线相邻的数字参见TS酶单位。图3说明在rHuTS中BVdUMP与脱氧尿苷一磷酸(“dUMP”)竞争。在不存在(三角形)和存在(方形)20μMBVdUMP下，体外进行将dUMP转化为dTMP的胸苷酸合成酶催化的反应。dUMP的浓度范围是10-100μM，N5，N10-亚甲基四氢叶酸浓度是140μM，酶浓度是0.1μM。通过测量A340的增加测定酶活性。图4说明证明与BVdUMP的预先温育不灭活rHuTS的实验结果。人胸苷酸合成酶在反应混合物中与和不与125μM的BVdUMP预先温育。20小时后，加入BVdUMP至125μM的浓度，dUMP至125μM的终浓度，加入N5，N10-亚甲基四氢叶酸至70μM的浓度。通过测量A340的增加测定胸苷酸合成酶活性。实心圆(预先温育的反应)，虚心圆(没有预先温育的)。图5是体外反应产物的结构òrHuTS催化的BVdUMP的体外反应的产物的结构。结构I和II与没有细胞的反应混合物中鉴定的质量离子相吻合。图6是提出的NB1011激活的机理。NB1011一定能够进入细胞并且在与TS反应之前转化为BVdUMP。推测TS转化后产生的结构是外环嘧啶核苷一磷酸。这些化合物可以通过各种机理而对细胞有细胞毒性，包括干扰核苷和核酸代谢。图7说明对用NB1011处理过的H630R10细胞中BVdUMP的检测。用100μM NB1011将H630R10细胞处理5天，然后进行材料与方法中描述的LC/MS分析。图8证明NB1011不会在体外不可逆灭活TS。完整细胞内NB1011对TS活性的作用完全是可逆的。根据材料与方法中所述，通过从5-脱氧尿苷释放2O测定完整RKO细胞内TS活性。通过更换新鲜培养基，在37℃下培养60分钟，然后重复该过程，从细胞中洗出NB1011。对对照和未处理过的细胞进行相同的洗涤程序。图9说明NB1011和抗-HER2要求的体外效力之间具有显著的相似性。A).从表3，4和7采集的数据。B).来自Shepard等(1991)临床免疫学杂志(J.Clin.Immun.)11(3)117-27的数据。纵向条块表示利用Mann-WhitneyU测定计算的平均值的标准误差。图10说明NB1011具有对托木迪斯(Tomudex)抗性癌症的高活性。根据下面材料与方法所述，在alamar蓝分析中测定对TDX8细胞系的细胞毒性。图11说明人正常和肿瘤结肠组织中胸苷酸合成酶的转录水平。据下面材料与方法所述进行RT-PCR分析。都校正为β-肌动蛋白的肿瘤与正常组织样品中TSmRNA的比例(从左至右)是14.35，7.31，0.75，59.5，2.53，24.1和4.0。图12A说明NB1011抑制5-FU抗性结肠癌的生长。治疗携带H630R10(5FU抗性)人结肠癌的裸鼠。在治疗的第一天(第一天)开始测量肿瘤。图12B是对NB1011的长期反应。第25天对收集的数据进行分析。统计学分析在下面的材料与方法章节中描述。图13是说明多种人组织中TS的mRNA水平的示意图。通过利用RT-PCR测定TSmRNA水平。定量测定相应于胸苷酸合成酶的DNA带并且通过分子动力学反应(Molecular Dyuamics Storm)校正为β-肌动蛋白的情况。1-20栏表示人正常组织中TSmRNA水平。表达水平表示为相对于结肠(16栏)的值。第21和22栏表示7对结肠正常组织和癌症组织中平均TS转录水平。表达值是相对于本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种选择性抑制病理细胞的方法，其中所述细胞特征在于过度表达内源胞内激活酶，并且其中所述酶不被底物前体药物化合物灭活，该方法包括使细胞接触有效量的具有通过激活酶在细胞内选择性转化为毒素从而选择性抑制病理细胞增殖的结构的底物化合物。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：HM施帕德，
申请(专利权)人：新生物公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]