一种生物芯片的纳米放大检测方法技术

本发明专利技术涉及的生物芯片的纳米放大检测方法，其特征在于：方法包括的步骤是：用纳米直径的金属颗粒标记核酸或蛋白；将标记的核酸或蛋白与生物芯片上的探针或组织杂交结合；利用能与该标记的纳米直径的金属颗粒发生金属相反应的金属试剂与已杂交结合在生物芯片上的核酸或蛋白上标记的纳米金属反应，放大纳米金属颗粒并进行普通光学检测。本发明专利技术采用的纳米放大技术，能够把杂交的信号放大到１０↑［４－８］倍，具有高的检测灵敏度和特异性；可以避免ＰＣＲ反应，从而简化了样品的处理过程，缩短了检测时间；不需要昂贵的检测仪，降低了芯片的使用成本及实验条件。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物芯片领域，特别是一种生物芯片的纳米金属放大检测方法。然而到目前为止，国内外均无获得批文的生物芯片产品供应市场用于临床，特别是可直接应用于普通实验室及野外环境的生物芯片及其检测系统尚未见有研制成功的报道。其主要原因是使用的方法存在着各种不足。如在标记方法上，荧光法是目前使用最多的方法，但它的灵敏度不高、需要避光，杂交完成后要快速检测以免荧光淬灭，另外结果检测需用价格极其昂贵的激光扫描仪等特殊设备；同位素标记法由于需要同位素和放射自显影，有使用不便，操作复杂，耗时较长、有污染的缺点。由于标记技术和杂交信号放大技术的限制，为提高检测灵敏度和特异性，通常的做法是在标记和分析前对样品进行适当程序的扩增，最常用的是PCR技术。然而，用荧光标记会影响PCR扩增效率，同位素标记常用的如32P和33P半衰期又太短，均不易推广使用。而且PCR扩增既需要设计引物，又要PCR仪，需要对各检测对象的靶序列建立不同的扩增体系、扩增方法和扩增条件，这便大大增加工作量和工作难度。为了解决这些问题，国内外不少公司进行了各种探索，但目前方法尚未达到实际应用。总之，尽管芯片技术已经取得了长足的发展，得到世人的瞩目，但在样品的制备、探针合成与固定、分子的标记、数据的读取与分析等几个方面仍然存在着许多难以解决的问题。特别是技术成本昂贵、复杂、检测灵敏度较低、重复性差、分析泛围较狭窄等问题限制了该技术在生物检测中的应用。而这些问题的核心原因主要在这两个方面即为提高灵敏度使用的是杂交前信号放大技术，以及用于标记杂交样品的信号报告分子存在各种不足。纳米直径的金颗粒用于生命科学研究中示踪技术已有较长的历史，由于它具有化学性质稳定，可标记于蛋白和核酸。同时，它与银反应后可形成比原来体积大106倍的黑色颗粒，可以用肉眼观察或用普通记录装置如照相、扫描记录的特点，近年来受到了科研人员的重视，特别是用不具备吸附能力离散的纳米金作为信号报告分子的应用则是近年生物信号检测中的一个重要进展。目前，作为信号报告分子的纳米金多采用的是胶体金。胶体金由于不是具有固定结构的单一分子，其表面在生理pH下带正电荷，因此，它不需要特别处理就可以同带负电荷的寡核苷酸结合。但是，这种结合是不牢靠的。后者是由不同数量的金原子构成的一个大分子复合体，金原子位于这个大分子的表面通过卤化物离子使其构成稳定的立体构型。由金原子构成的纳米金颗粒不带电荷，但由于金原子位于颗粒的表面，对其进行特定修饰就可以使其与核酸形成共价结合，那么就将纳米金颗粒标记到特定的核酸、蛋白上，可作为信号报告分子使用。由于是共价结合，因此，它比胶体金有更多的优越性。1996年NATURE杂志同时发表了两篇将DNA作为连接分子使纳米金自组装成纳米结晶的报道，1997年Zehbe报道了用纳米金作为信号报告分子的原位杂交技术，在结合银显影的情况下，可使对组织中病毒核酸的检测灵敏度由10～50个拷贝提高到1个拷贝，作者认为如此高的灵敏度可以使该方法在很多应用中代替原位PCR技术。但目前尚未见有该技术用于生物芯片检测技术中的报道。本专利技术所采用的技术方案是这样的即，其特征在于方法包括以下三个步骤(一)、用纳米直径的金属颗粒标记核酸或蛋白；(二)、将标记的核酸或蛋白与生物芯片上的探针杂交结合；(三)、利用能与该标记的纳米直径的金属颗粒发生金属相反应的金属试剂与已杂交结合在生物芯片上的核酸或蛋白上标记的纳米金属反应，放大纳米金属颗粒并进行普通光学检测。本专利技术所使用的术语“生物芯片”是由生物大分子或组织附着于玻璃、陶瓷、金属片或尼龙膜、硝酸纤维素膜等基片物质上构建而成的阵列。生物芯片的实例包括基因(核酸)芯片、细胞芯片、蛋白芯片、抗体芯片或组织芯片等。本专利技术所述的核酸包括DNA、RNA、cDNA或肽核酸。本专利技术所述的蛋白包括各种抗体、抗原。本专利技术所使用的术语“纳米直径的金属颗粒”是指直径在1.0-1000nm之间的金属颗粒。其实例包括纳米金、纳米钒、纳米铅或纳米银等，还包括修饰结合有胺基、巯基、酰基或生物素等基团的纳米直径的金属颗粒。本专利技术使用的优选的纳米直径的金属颗粒是直径为1.4nm的单顺丁烯二乙酰亚胺修饰的纳米金。本专利技术所述的能与该标记的纳米直径的金属颗粒发生金属相反应的金属试剂包括金、银、铁等纯的金属试剂以及含金属的化合物试剂，如锂银、氢醌银。本专利技术使用的优选的能与纳米金发生颗粒增强反应的金属试剂是锂银。本专利技术上述步骤(一)中，纳米直径的金属颗粒标记核酸的方法包括(1)通过寡核苷酸接头实现对核酸的标记； 或(2)通过引物实现对产物核酸的标记；或(3)直接对核酸实现的标记。本专利技术所使用的术语“寡核苷酸接头”是指由1-2000个碱基组成的一段核酸物质，包括进行了修饰有如巯基、氨基、酰基等基团的。本专利技术使用的优选的与1.4nm的单顺丁烯二乙酰亚胺修饰的纳米金反应的寡核苷酸接头是5’-AAA AAA AAA AA-(CH2)6-SH-3’。本专利技术所使用的术语“引物”、“PCR”、“RT-PCR”定义参考《PCR技术实验指南》，C.W.迪芬巴赫，G.S.得维克斯勒。科学出版社，1998年8月第一版。本专利技术所使用的术语“产物核酸”是指由PCR或RT-PCR反应生成的核酸物质，如DNA、cDNA。上述步骤(一)中的通过寡核苷酸接头实现对核酸的标记方法的步骤包括(1)、制备纳米金属溶液；(2)、将纳米金属溶液与寡核苷酸混合，纳米金属与寡核苷酸分子数之比为1-100∶1，反应获得含纳米金属的寡核苷酸接头；(3)、提取标本DNA，通过去磷酸化反应去除DNA的5’端的磷酸基团，防止其自身连接；(4)、在连接酶作用下，结合纳米金属标记的寡核苷酸接头与上述处理的标本DNA，获得纳米金属标记的样本DNA。所述步骤(一)中通过引物实现对产物核酸标记方法中，采用通过PCR反应引物实现对产物DNA的标记，方法的步骤包括(1)、制备纳米金属溶液； (2)、将纳米金属溶液与PCR引物混合，纳米金属与引物分子数之比为1-100∶1，得到纳米金属标记的PCR引物；(3)、利用该标记引物进行PCR反应，得到纳米金属标记的PCR产物DNA。所述步骤(一)中通过引物实现对产物核酸标记方法中，采用通过RT-PCR反应引物实现对产物cDNA的标记，方法的步骤包括(1)、制备纳米金属溶液；(2)、将纳米金属溶液与RT-PCR引物混合，纳米金属与引物分子数之比为1-100∶1，得到纳米金属标记的RT-PCR引物；(3)、利用该标记引物进行RT-PCR反应，得到纳米金属标记的RT-PCR产物cDNA。上述步骤(一)中采用的直接对核酸实现的标记方法为通过与核酸的末端基团反应，从而使核酸末端修饰有含硫或含二酰亚胺类的化合物，该类化合物可以和纳米金属反应，实现纳米金属对核酸的标记。上述步骤(一)中纳米直径的金属颗粒标记蛋白的方法步骤为(1)、制备纳米金属溶液；(2)、纳米金属溶液与还原处理的蛋白混合，纳米金属与蛋白分子数比不低于5∶1，得到纳米金属标记的蛋白。所述步骤(二)中的纳米金属标记的核酸与生物芯片上的探针杂交的步骤是(1)、对纳米金属标记的DNA进行变性处理；(2)、滴加变性处理的纳米金属标记的DNA于生物芯片表面，进行杂交反应； (3)、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物芯片的纳米放大检测方法，其特征在于：方法包括以下步骤：（一）、用纳米直径的金属颗粒标记核酸或蛋白；（二）、将标记的核酸或蛋白与生物芯片上的探针或组织杂交结合；（三）、利用能与该标记的纳米直径的金属颗粒发生金属相反应的金属 试剂与已杂交结合在生物芯片上的核酸或蛋白上标记的纳米金属反应，放大纳米金属颗粒并进行普通光学检测。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周元国，顾大勇，鲁卫平，熊仁平，刘霞，申海鹰，陈星云，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]