重组核酸序列和检测样品的基因毒性与诱变性以及基因毒性的动力学的方法技术

公开了包含诱导率高于４０的ＳＯＳ调节的启动子的重组核酸序列，所说的启动子被有效地连接到编码报道分子的核酸序列上，所编码的报道分子能产生可以发光形式测定的信号。还公开了包含这样的核酸序列的生物传感器，以及使用这种生物传感器检测基因毒性和多种基因毒性化合物的存在的方法。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本申请是1996年4月25日提交的中国专利技术专利申请96180308.8(题目为“”)的分案申请。目前有多种不同的使用微生物筛选基因毒性和/或毒性化合物的方法。Ames测试(Maron and Ames，1983)似乎是一种最广泛使用的测定毒性化合物的方法并因而在世界范围内被推荐使用。但完成该测试要花费大约三天的时间，同时该方法还伴有一些明显的缺点。已引入了某些可短时间内完成的方法，这些方法包括，根据lacZ基因表达的β半乳糖苷酶的量来检测因DNA损伤引起的SOS反应，其中所说的lacZ基因位于SOS调节的umuD、C或sfiA应激诱导型启动子的下游。这些测试分别称为使用鼠伤寒沙门氏菌作为宿主微生物的umu测试(Oda等，1985)和使用大肠杆菌作为宿主微生物的SOS显色测试(Quillardat等，1982)。在umu测试和SOS显色测试中，在待检样品存在下培养宿主微生物，继之破坏该宿主微生物。然后加入β半乳糖苷酶的底物，约10分钟后加入抑制剂终止随后的反应，然后在两个波长处进行OD测量并计算β半乳糖苷酶活性。这些测试克服了Ames测试耗时长的问题，但它们也有自身的缺点，即灵敏度低而且检测时间仍需7-8小时，特别是硝基芳烃和多环芳烃的检测灵敏度低。另外，该检测方法还需要大量的操作和加入各种不同的试剂，从而使该方法很复杂并且花费高。由于为了检测任何诱导作用而必须破碎细胞，所以只可能对细胞进行一种检测。EP-A-0649905述及，将SOS基因放在表达荧光素酶活性的基因上游，以使荧光素酶的表达与SOS基因的表达同时发生，从而可以克服上述测试的缺点。然后通过检测发光可在短时间里检测或测定诱变物质。据称任何SOS基因都是有用的，并且在实施例中以umuD、C基因(当用于umu测试中时)为例作了说明。另外，与SOS显色测试和umu测试等常规测试相比，由于该测试中检测所需的样品体积较小，所以认为其提高了检测的灵敏度。除了其必须是SOS可诱导型外，再没有与待用启动子相连的序列。又因为发光是即刻的，所以可以比使用Lac系统更早地进行检测，从而缩短了检测时间。WO94/13831(DuPont)中还公开了与发光基因复合物结合使用应激诱导型启动子，以提供基因工程微生物。他们指出，“虽然已证明应激反应在检测各种环境危害中是有用的，但它须与易于检测的灵敏报道基因相连接”。DuPont公司提供了一个广泛的现有技术中已知的应激诱导型启动子清单，这些启动子可能是有用的，但本专利技术不只限于这些。所列清单包括下列调节系统的启动子热休克、SOS、过氧化氢、超氧化物、脂肪酸饥饿、通用应激、静止状态、应急、分解代谢产物活化、P利用和N利用。在实施例中，他们使用了热休克调节的蛋白质启动子dnaK和grpE、SOS调节的启动子recA和uvrA、氧化损伤调节的启动子katG和micF、通用应激启动子uspA、静止期启动子xthA、来自氨基酸饥饿系统的his启动子、涉及碳饥饿系统的lac启动子、来自磷酸盐限制系统的phoA启动子和来自氮限制系统的glnA启动子。估计他们从很宽范围的不同调节方式的启动子中举出如此多的例子，是要说明他们的系统具有宽范围的适用性。其中未指出或可推断中优选使用某个特定组的启动子或任何个别启动子。只在其中的一个实施例(专利申请的实施例12)中明显地列举了一个特定的SOS调节的启动子，其中给出了SOS调节的启动子recA得到的结果。使微生物与加有诱变剂溴乙锭(浓度为0.25mg/ml)的样品接触，于加入诱变剂后180分钟测得诱导率为1.9。加入0.5μg/ml丝裂霉素C，100分钟后测定诱导率。依据所用测试菌株的不同，诱导率在4.7至20之间变动。根据DuPont的专利申请的实施例12可明显看到上述结果。我们已不可预见地发现了一个应激诱导型启动子的亚组，即一个SOS调节的启动子的亚组，其与发光报道基因结合用于微生物系统估测致突变性得到了改善的结果。该亚组并不包括SOS调节的RecA启动子。该亚组具有许多优于DuPont RecA-荧光素酶系统及本领域已知的其它微生物毒性测试系统的特点。在以特定方式使启动子突变而进一步测试和开发这些新的系统中，我们能够更大程度地改善其性能。此外还完成了新的测试方法。这些新测试方法使我们能够获得迄今任何已有的微生物毒性测试中未曾述及的、更多更好的数据。本专利技术涉及包含诱导率高于40的、SOS调节的启动子的重组核酸序列，所说的启动子被有效地连接到编码报道分子的核酸序列上，所编码的报道分子能产生可以发光形式测定的信号。在根据本专利技术，重组核酸序列中优选含有更高诱导率的、特别是高于50的诱导率的启动子。可按照诸如M.Schnurr等人在Biochimie(1991)73，423-431中公开的方法检测诱导率。另外，也可选用Peterson K.R.和Mount D.W.(1987)，分子生物学杂志，193，27-40中所述的方法。这些公开内容均列为本文参考文献。现有技术中公开的与荧光素酶联合使用的recA启动子并不落入这一大类中，因为recA的诱导率要低得多。其在30°的诱导温度下为11X。诱导率是一个本领域公认的术语，并且可按本领域技术人员已知的方法确定。该文献的实施例中给出了如何确定诱导率的方法，并确定了大量启动子的许多数值及诱导率。recA的低诱导率可能是它为什么不特别适用于基于启动子诱导作用的灵敏检测系统的原因。在SOS调节的系统中，RecA启动子是最早被诱导的启动子。因代谢物缺乏而产生的信号被RecA蛋白质所识别。其也可能在诱变中具有第二种功能即能辅助DNA聚合酶绕过损伤。在DNA损伤后的前20分钟内，uvrA、B、C、D基因被激活，开始切割修复。然后在大约40分钟的时间内称为RecF重组途径的重组性修复途径很活跃。最后才得以诱导涉及umuD、C的SOS诱变途径。上述专利申请中举例的DuPont系统所使用的丝裂霉素C的最低水平是500ng/ml。其中没有给出可检测更低诱变剂水平的指征和提示。而在本系统中则可以检测到7ng/ml的丝裂霉素。因此本系统要比DuPont系统中所指出的灵敏度要高大约80倍。我们发现，在我们的系统中从7.5ng/ml的浓度得到的诱导率高于2。我们第一次举例说明了联机检测。因为用SOS或Ames系统需要破坏细胞，所以用这些系统进行联机检测是不可能的。所描述的其他测试也只是用于单一点检测。我们现已发现，有可能分辨样品中存在的多种诱变剂，并确定这些物质的诱导动力学。总体上不可预见的是，若定时检测发光，多种诱变剂的存在将提供不同的可检测信号。人们可能预计的是反面情况，即出现累积效应。但其清楚地说明，SOS调节的启动子构成了一组表现出这种调节特征的启动子，即对于各种不同的诱导性化学物质来说，诱导方式多有不同，因而存在着有差异的可检测信号。该新的方法应用上极为简单，而且可实现信号检测的自动化。该新方法只需培养包含SOS调节的启动子的微生物，所说的启动子被可效连接到编码报道分子的核酸序列上，所说的报道分子能产生可以发光形式测定的信号，并使微生物与待测样品接触，然后—测定培养物中的发光，所说的测定是在不同时间点进行的，—确定在所说时间点上的信号-噪音比，—对数据作图，所说的数本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含诱导率高于４０的ＳＯＳ调节型启动子的重组核酸序列，所说的启动子被可操作地连接到编码报道分子的核酸序列上，所编码的报道分子能产生可以发光形式测定的信号，该启动子选自ＲｅｃＮ或突变的ＲｅｃＮ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：D范德勒列，BMF伯雷曼斯，AIA普罗沃斯特，LALJB里格尼尔斯，LPE沃斯查夫，
申请(专利权)人：佛兰芒技术研究所，
类型：发明
国别省市：BE[比利时]