一种检测牛奶共轭亚油酸组成和含量的方法技术

一种快速检测牛奶共轭亚油酸（ＣＬＡ）组成和含量的方法，是从牛奶中通过两步超速离心分离出乳脂肪，第一步离心力为１７０００ｇ－１８５００ｇ，离心温度控制在４～８℃，离心时间２０～４０分钟，第二步离心力为１８５００ｇ－２５０００ｇ，离心温度控制在１８～２５℃之间，离心时间２０～４０分钟；通过脂肪酸酯化过程，使分离出乳脂肪中的脂肪酸形成甲基酯；通过气相色谱检测牛奶的脂肪酸组成和含量。本发明专利技术的方法可以确定牛奶的脂肪酸组成和含量，尤其对于牛奶ＣＬＡ和Ｃ１８：１异构体具有很好的分离效果。本方法与经典的参考方法相比，对于乳脂肪酸组成没有显著的影响，但弥补了经典方法存在耗时、工作量大、环境污染、成本高和处理效率低缺陷，每天可以处理３００个样品，能极大地提高分析效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是一种快速检测牛奶共轭亚油酸(CLA)组成和含量的方法，以气相色谱技术为核心，主要针对乳脂肪的分离、CLA异构体和十八碳单烯酸异构体的分离和区分，通过物理方法从牛奶中分离脂肪后进一步利用100米长毛细管柱分离CLA和十八碳单烯酸异构体，属于分析方法学领域。
技术介绍
CLAs是一组十八碳二烯酸结构和位置异构体的总称，理论上应该包括14种位置异构体，同时每个位置又有两种不同几何异构体(即顺式和反式)，因此总共有56种异构体。但CLA的最初来源仅限于具有抗癌作用的反刍动物源性异构体(c9t11CLA)。该物质最初在瘤胃内容物中发现，所以又称瘤胃酸。由于CLA具有独特的生物学功能，因此关于CLA的相关研究已成为近几年国际研究热点之一。研究表明，反刍动物产品是人类获取天然CLA的主要生物来源，但乳脂肪中有400多种不同的脂肪酸，而CLA只是其中的一种具有共轭双键的微量多不饱和脂肪酸。目前乳脂肪经典的分析方法是用有机溶剂提取乳脂肪，然后通过酯化形成脂肪酸甲基酯(FAME)，随后进行层析分离(如利用气相色谱，GC)。但是目前对于牛奶CLA和C18:1(t-C18:1和c-C18:1)异构体的分析还没有国际一致的标准。在乳脂肪的提取过程中，使用大量的(至少比样品多15倍以上)氯仿甲醇和水(8∶4∶3)混合物具有很好的提取效果，但由于氯仿具有毒性，同时脂肪层容易结合到界面处的蛋白层上，因此从安全、实验室污染和分离效果的角度考虑，不宜利用氯仿批量处理样品。Forch(1957)和Bligh(1959)的方法是从组织提取脂肪的经典方法，而Hara和Radin(1978)建立的利用有正己烷和异丙醇混合物提取乳脂肪的方法目前应用十分广泛，但该方法步骤繁琐，每天最多处理40个样品，当样品量少时，应用该方法比较适合。如果大批量处理样品时，该方法的应用受到限制。利用GC确定挥发性衍生物是GC分析的一个必要步骤，而FAME具有较高的挥发性，因此脂肪酸的测定通常将其甲酯化后测定。常用的甲酯化试剂有盐酸(HCL)、硫酸(H2SO4)、三氟化硼(BF3)和甲醇钠(NaCH3)。HCL容易准备，适合于所有普通的脂类结构，例如游离脂肪酸、酯、酰胺、甘油脂等。盐酸催化甲酯化的过程通常在80度能够反映完全。在该条件下，共轭系统异构化而增加t，t异构体的含量，同时使CLA产生含甲氧基的副产物。降低温度，如60度或者室温后虽然降低了异构化的发生，但甲酯化不完全。硫酸对共轭双键的异构化作用于盐酸相似，一般在催化异丙脂的过程中应用较广。利用BF3除了不稳定外(即使在冷藏保存时)，其它和HCL具有类似的优缺点。因此不利于CLA的分析。利用NaCH3在50度加热10到15分时能够很快的形成FAME，当室温过夜时也能完全的转化，随后FAME可以利用正己烷提取。利用碱作催化剂的好处可以避免CLA的异构化，但和一些游离脂肪酸和酰胺类脂不发生反应。CLA可经酸、碱催化后形成FAME，利用气相色谱(GC)分析，但由于酸催化可改变共轭稀中双键的构型而容易形成产生人造CLA，故酸催化法一般不常用。碱催化法分析效果较好，当采用甲醇钠或四甲基胍(TMG)作为酯化剂时，虽不产生异构体和人造CLA，但不能甲基化游离脂肪酸和N一结合脂肪酸(如鞘酯)。目前通过化工碱法催化亚油酸或催化富含亚油酸的油脂而合成的CLA，主要含有两种异构体，即c9t11C18:2和t10c12C18:2，但同时也形成两种副产物，即t8，c10-C18:2和c11，t13-C18:2。因此，上述两种方法均不适宜于分析游离脂肪酸高的样品。CLA中共轭双键的稳定性较亚油酸(LA)低，与花生四稀酸(C20:4，n-6；)和二十二碳六稀酸(C22:6，n-3，DHA)相似，因此，在分析此类脂肪酸前应防止其发生异构化和氧化。随着分析技术的发展，现已能利用气相色谱、银离子交换液相色谱、红外光谱及电离质谱等进行CLA异构体的定量分析，但这些研究结果并不能完全适用于牛奶脂肪酸样品的分析上。例如当利用甲醇钠时，无法分析乳脂肪中的鞘磷脂和游离脂肪酸。但这些方法耗时、工作量大、成本高，而且不利于大批量的处理样品。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种快速检测牛奶共轭亚油酸(CLA)组成和含量的方法。该方法可以提高乳脂肪的分离效率和质量和定量分析牛奶中优势CLA和C18:1异构体。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案一种快速检测牛奶共轭亚油酸(CLA)组成和含量的方法，是从牛奶中通过两步超速离心分离出乳脂肪，第一步离心力为17000g-18500g，离心温度控制在4～8℃，离心时间20～40分钟，第二步离心力为18500g-25000g，离心温度控制在18～25℃之间，离心时间20～40分钟；然后通过脂肪酸酯化过程，使分离出乳脂肪中的脂肪酸形成甲基酯；最后通过气相色谱检测牛奶的脂肪酸组成和含量。其中，第一步离心力应不低于17000g，但要比第二步离心力低，第一步离心力为17000g-18500g；第二步离心力应不低于18500g，但从目前使用的离心机来看，离心机的离心力都不超过25000g，因此，第二步离心力为18500g-25000g。离心力RCF(g)与离心机转子的转速(rpm)的换算关系为RCF(g)＝1.11×10-6(rpm)2r，其中，RCF(g)为离心力；rpm为离心机转子的转速；r(mm)为旋转半径。因此，离心力RCF(g)可以通过所使用的离心机的旋转半径、控制离心机转子的转速得到。乳脂肪中有400多种不同的脂肪酸，而CLA仅其中的一种具有共轭双键的微量多不饱和脂肪酸。目前乳脂肪经典的分析方法是用有机溶剂提取乳脂肪，然后通过酯化形成脂肪酸甲基酯(FAME)，随后进行层析分离(如利用气相色谱，GC)。因此，如果直接将乳脂肪酸的分析方法应用于牛奶CLA的分析过程中会有很多局限性。经典方法在乳脂肪的提取过程中，常使用大量的毒性有机溶剂。而本专利技术的方法是采用两步超速离心分离乳脂肪，对于牛奶CLA和C18:1异构体具有很好的分离效果，本专利技术的方法可以提高乳脂肪的分离效率和质量和定量分析牛奶中优势CLA和C18:1异构体。在本专利技术的快速检测牛奶共轭亚油酸(CLA)组成和含量的方法中，所述的脂肪酸酯化过程是利用酸碱混合甲酯化的方法使脂肪酸形成甲基酯，在其甲脂化的过程中，先加2wt％的氢氧化钠甲醇溶液于分离的乳脂肪中，振荡后在48-55℃水浴10-20分钟，然后加入5vt％的盐酸/甲醇溶液在78-82℃水浴40分钟-1小时20分钟后冷却到室温。在本专利技术的快速检测牛奶共轭亚油酸(CLA)组成和含量的方法中，在其甲脂化的过程中，其优选的工艺参数是先加2wt％的氢氧化钠甲醇溶液于分离的乳脂肪中，振荡后在50℃水浴15分钟，然后加入5vt％的盐酸/甲醇溶液在80℃水浴1小时后冷却到室温。所使用的氢氧化钠甲醇溶液为2wt％(质量百分比)的氢氧化钠甲醇溶液；盐酸/甲醇溶液为5vt％(体积百分比)的盐酸/甲醇溶液。脂肪酸的测定通常将其酯化后测定，经典方法在脂肪酸酯化的过程中，常单纯的使用酸或者碱作为催化剂，容易造成CLA异构体的异构体化(单独使用酸，如盐酸、硫酸或三氟化硼)或者不能完全酯化脂肪酸(当单独使用碱时，如利用甲醇钠本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测牛奶共轭亚油酸（ＣＬＡ）组成和含量的方法，其特征在于：是从牛奶中通过两步超速离心分离出乳脂肪，第一步离心力为１７０００ｇ－１８５００ｇ，离心温度控制在４～８℃，离心时间２０～４０分钟，第二步离心力为１８５００ｇ－２５０００ｇ，离心温度控制在１８～２５℃之间，离心时间２０～４０分钟；然后通过脂肪酸酯化过程，使分离出乳脂肪中的脂肪酸形成甲基酯；最后通过气相色谱检测牛奶的脂肪酸组成和含量。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王加启，卜登攀，周凌云，刘仕军，于建国，
申请(专利权)人：中国农业科学院畜牧研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]