一种检测鲜牛奶和巴氏牛奶中还原奶的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测牛奶中还原奶含量的方法，属于牛奶及其奶制品质量检测应用技术领域。包括（一）样品预处理：牛奶样品与稀盐酸按１∶２～１∶６体积比混合，１１０℃加热２４小时，样品水解后利用Ｃ１８柱纯化过滤；（二）液相色谱法测定纯化后的样品中呋喃甲基赖氨酸的含量：色谱条件为三氟乙酸、乙酸和氯化钾溶液从１００％到５０％浓度梯度洗脱，紫外检测波长范围在２６０～３３０ｎｍ；（三）结果判定：每１００克乳蛋白质中呋喃甲基赖氨酸含量低于或等于８ｍｇ则判定为不含还原奶成分；每１００克乳蛋白质中呋喃甲基赖氨酸高于８ｍｇ的判定为含有还原奶成分。本发明专利技术的优点是：能够对生鲜牛奶和巴氏牛奶中是否使用还原奶做出快速的判断，能够检出最低还原奶的含量为５％。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，更具体地说是以液相色谱技术为核心，以奶粉生产过程中的特征产物为检测依据，检测出生鲜牛奶和巴氏牛奶中是否添加利用奶粉生产的还原奶的方法，属于牛奶及其奶制品质量检测应用

技术介绍
近些年随着我国奶业的迅速发展，逐步呈现出来奶源不足的局面。同时由于大量奶粉进口，因此出现了利用奶粉生产还原奶而充当鲜奶谋利的现象，不仅造成行业内部不平等竞争并扰乱行业秩序，酿成了“倒奶”事件和因奶粉质量问题引发的“阜阳奶粉事件”等有关牛奶质量安全和消费者健康的问题。因此，如何区分鲜奶和巴氏牛奶中是否含有还原奶意义重大。奶粉在制造过程中，蛋白质会因热处理过程而发生梅拉德反应，而生成一系列特征性的反应产物，而鲜奶中这些物质的含量少，因此本专利技术用该特征反应产物来检验鲜奶中的奶粉含量。梅拉德反应是一种蛋白质和还原性糖之间非酶参与的自发褐变过程，该反应的早期阶段，乳蛋白(主要是k-酪蛋白)的游离氨基酸和乳糖形成希夫碱，该物质进而通过Amadori变化后形成稳定的复合物。在梅拉德反应的延伸阶段，会产生许多中间代谢产物，如呋喃、苦味物质、吡咯衍生物、吡嗪、吡喃酮、内酯和咪唑衍生物等。这些代谢产物会产生异常的风味，降低奶制品的营养价值。目前对于梅拉德反应产物的分析主要集中在分析必需氨基酸(如赖氨酸)的损失、羧甲基赖氨酸的形成、5-羟甲基呋喃、褐变指数(吡咯衍生物)和半乳糖苷异麦芽酚等。但鲜奶、奶粉以及当牛奶在热处理的过程中，这些物质的含量并不稳定，因此很难利用这些物质作为还原奶区分的指标。另外，对于上述物质的检测方法需要利用氨基酸分析仪和色谱等仪器，处理过程烦琐而且耗时，费用高。
技术实现思路
本专利技术针对上述现状，旨在解决鲜奶和巴氏牛奶中使用还原奶难以检测的技术难题，建立一种快捷可靠、操作简单的分析方法，采用以下技术方案，包括以下步骤(一)样品预处理牛奶样品与8～12mol/L稀盐酸按1∶2～1∶6体积比混合，105～120℃加热16～24小时，样品水解完全后冷却并通过C18萃取柱(Waters Sep-pakCartriges)过滤，用3～6倍样品体积的2～4mol/L的盐酸溶液洗脱；(二)液相色谱法测定呋喃甲基赖氨酸取步骤(一)得到的洗脱液通过色谱柱(Waters Atlantis dC18 5μm 4.6*250mm)测定呋喃甲基赖氨酸的含量，流动相甲醇-三氟乙酸，梯度洗脱，0.1％三氟乙酸100％～87％；流速1.0ml/min；检测波长260～330nm；柱温32℃；(三)结果判定检测结果小于等于8mg/100克乳蛋白质判定为不含还原奶成分；高于8mg/100克乳蛋白质判定为含有还原奶成分；所含还原奶的含量为X，待测样品中呋喃甲基赖氨酸的含量(mg/100g蛋白质)＝4*(1-X)+60X+1。样品预处理过程中的稀盐酸优选10～11mol/L，最优选10.6mol/L；牛奶样品与稀盐酸优选按1∶3体积比混合。加热水解的温度优选110℃，加热24小时。样品水解完全后冷却并通过C18柱过滤，用3倍样品体积的3mol/L的盐酸溶液洗脱。高效液相色谱法测定呋喃甲基赖氨酸的含量步骤中，梯度洗脱范围优选100％到86％，紫外检测波长优选280nm。牛奶在加热过程中会发生梅拉德反应，使蛋白质和糖生成特定的产物--呋喃甲基赖氨酸。本专利技术研究揭示了市售牛奶中，呋喃甲基赖氨酸含量主要有三个来源1)原料奶；2)还原奶所用奶粉；3)巴氏灭菌过程产生。因此可以根据呋喃甲基赖氨酸的来源对巴氏牛奶是否使用还原奶作出判断。原料奶中呋喃甲基赖氨酸的含量按3mg/100克蛋白质计，奶粉中呋喃甲基赖氨酸的最低含量按65mg/100克蛋白质计，而在巴氏消毒过程中，因受热处理产生的呋喃甲基赖氨酸约为1mg/100克蛋白质。本研究还发现，每100克生鲜牛奶蛋白中呋喃甲基赖氨酸的含量仅有4～5mg，巴氏纯牛奶中该物质的含量最高不超过8mg/100克蛋白质，而大多数奶粉该物质的含量在165～338mg/100克蛋白质。因此，能够据此鉴别鲜牛奶和巴氏牛奶中是否添加了还原奶，并且计算得到还原奶的加入量。本专利技术的优点在于本专利技术非常巧妙地选取了在奶粉加工过程中对热敏感的呋喃甲基赖氨酸为作为检测的特征性指标，揭示了牛奶巴氏处理过程中呋喃甲基赖氨酸含量的变化规律，通过大量具有统计意义的试验得出了鲜奶、巴氏牛奶和奶粉中呋喃甲基赖氨酸的含量范围，揭示了牛奶中呋喃甲基赖氨酸的含量随还原奶的量的增加而增加的规律。本专利技术还提供了一种检测呋喃甲基赖氨酸的分析方法及计算公式，其能够对生鲜牛奶和巴氏牛奶中是否使用还原奶以及还原奶的含量做出快速的判断，能够检出最低还原奶的含量为5％。采用本专利技术方法，对于规范市场巴氏牛奶质量、保证我国巴氏牛奶品种和品质能够提供科学的依据，有利于奶业健康发展。下面结合最佳实施方式对本专利技术做进一步说明，以使公众对
技术实现思路
有整体和充分的了解，而并非对本专利技术保护范围的限定。前述部分已经充分公开了本专利技术可以实施的保护范围，因此凡依照本专利技术公开内容进行的任何本领域公知的等同替换，均属于对本专利技术的侵犯。附图说明图1为呋喃甲基赖氨酸的标准物图谱。图2为某一生鲜牛奶样品中呋喃甲基赖氨酸的检测结果。图3为不同温度处理对呋喃甲基赖氨酸含量的影响。图4为鲜奶中不同还原奶含量对呋喃甲基赖氨酸含量的影响。图5为巴氏牛奶中不同还原奶含量对呋喃甲基赖氨酸含量的影响。图6为A、B和C样品中呋喃甲基赖氨酸的检测图谱。具体实施例方式以下实施例中使用的仪器和试剂Waters 2695系统，Waters 2487UV检测器、Waters Empower处理软件，Waters自动进样系统。盐酸分析纯 北京北化精细化学品有限责任公司，工作浓度为3mol/L甲醇色谱纯Fisher Scientific三氟乙酸色谱纯DIMA TECHNOLOGY INC 溶液浓度0.1％乙腈色谱纯 天津市西华特种试剂厂呋喃甲基赖氨酸标准物，纯度为99.8％，法国Neomps，2ug/ml超纯水巴氏牛奶标准品 农业部提供鲜牛奶样品来自中国农业科学院畜牧研究所试验牛场巴氏牛奶样品 农业部送检样品奶粉样品 超市发购买市售奶粉实施例1HPLC法分离检测赖氨酸衍生物的条件将呋喃甲基赖氨酸标准物用3mol/L盐酸溶液配制成2ug/ml的工作液。高效液相色谱法测定呋喃甲基赖氨酸取呋喃甲基赖氨酸工作液及样品各1ml，放入自动进样瓶中，进样体积10ul，洗脱条件。A为三氟乙酸，B为甲醇。表1 色谱条件色谱柱美国Waters公司Atlantis dC18柱(5μm，4.6mm×250mm)；流动相甲醇-三氟乙酸，梯度洗脱，0.1％三氟乙酸100％～87％；流速1.0ml/min；检测波长280nm；柱温32℃。采用紫外检测器进行检测。图1例为利用紫外检测器在波长为280nm处时化学纯呋喃甲基赖氨酸的分离检测图谱。检测结果说明样品分离很好，分离度＞1.2。需要注意的是由于Waters公司Atlantis dC18柱在此条件下稳定性比较差，柱流失比较严重，需要每10个样品中间必须加入一个标准，以校准保留时间。实施例2鲜牛奶中呋喃甲基赖氨酸的含量分别从16个不同来源的样品中取一定体积鲜牛奶进行检测(一)样品预处理本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测鲜奶和巴氏牛奶中还原奶的方法，其特征在于：通过ＨＰＬＣ法测定牛奶样品中的呋喃甲基赖氨酸的含量并对结果进行判断，包括如下步骤：（一）样品预处理：牛奶样品与８～１２ｍｏｌ／Ｌ稀盐酸按１∶２～１∶６体积比混合，１０５～１２０℃加热 １６～２４小时，样品水解完全后冷却并通过Ｃ１８柱（ＷａｔｅｒｓＳｅｐ－ｐａｋＣａｒｔｒｉｇｅｓ）过滤，用３～６倍样品体积的２～４ｍｏｌ／Ｌ的盐酸溶液洗脱；（二）液相色谱法测定呋喃甲基赖氨酸：取步骤（一）得到的洗脱液通过色谱柱 （ＷａｔｅｒｓＡｔｌａｎｔｉｓｄＣ１８５μｍ４．６＊２５０ｍｍ）测定呋喃甲基赖氨酸的含量，流动相：甲醇－三氟乙酸，梯度洗脱，０．１％三氟乙酸１００％～８７％；流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ；检测波长：２６０～３３０ｎｍ；柱温：３２ ℃；（三）结果判定：检测结果小于等于８ｍｇ／１００克乳蛋白质判定为不含还原奶成分；高于８ｍｇ／１００克乳蛋白质判定为含有还原奶成分；所含最低还原奶的含量为Ｘ，待测样品中呋喃甲基赖氨酸的含量（ｍｇ／１００ｇ蛋白质）＝４＊（１－Ｘ）＋６ ０Ｘ＋１。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王加启，卜登攀，周凌云，李树聪，于建国，
申请(专利权)人：中国农业科学院畜牧研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]