检测贝类中诺沃克病毒的实时荧光检测方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种快速检测诺沃克病毒的方法，在聚合酶反应体系中进行聚合酶链式反应，所述的反应体系中含有扩增诺沃克病毒的特异性引物对和诺沃克病毒特异性探针。本发明专利技术还提供了相应的试剂盒。本发明专利技术可快速简便地检测和鉴定诺沃克病毒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学和核酸检测
更具体地，涉及一种快速检测诺沃克病毒的方法和试剂盒。
技术介绍
食源性病毒污染是食品安全性问题的一个重要方面。引起腹泻的病原包括细菌、寄生虫、病毒三大类。引起腹泻的病毒包括轮状病毒(Rotavirus)、肠腺病毒(Entericadenovirus)、杯状病毒(Calicivirus)、星状病毒(Astovirus)。杯状病毒包括诺沃克(样)病毒和札幌病毒两大类。诺沃克病毒(Noroviruses)是一种分布很广泛的病毒，食品(包括水)被诺沃克病毒感染后，出现以急性胃肠炎为主的临床症状，即水样腹泻、呕吐和腹痛等症状。若治疗不及时或治疗方法不正确，轻者影响人体的生长发育，严重者可导致脱水死亡。该类病毒主要存在于贝类等体内。目前我国对进出口食品只进行常规的细菌检测，还没有相应方法对进出口食品诺沃克病毒进行检测。也就是说，进出口食品诺沃克病毒检测仍处于空白状态，这严重地制约着我国食品进出口贸易的发展，威胁着人民的身体健康。然而，目前尚没有快速简便地检测和鉴定诺沃克病毒的检测技术。因此，本领域迫切需要开发新的快速简便地检测和鉴定诺沃克病毒的技术。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种快速简便地检测和鉴定诺沃克病毒的技术。在本专利技术的第一方而，提供了一种聚合酶链式反应方法，它包括步骤在聚合酶反应体系中进行聚合酶链式反应，所述的反应体系中含有扩增诺沃克病毒的特异性引物对和诺沃克病毒特异性探针，并且所述引物扩增出的扩增产物具有诺沃克病毒ORF1和ORF2的连接区。在另一优选例中，所述的扩增诺沃克病毒的特异性引物对选自下组引物15’-GATGAGRTTYTCWGAYYTVAGCAC-3’，SEQ ID NO1；引物25’-GATGAGRTTYTCWGAYYTVAGCAC-3’，SEQ ID NO2。在另一优选例中，所述的诺沃克病毒特异性探针具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。在另一优选例中，所述的诺沃克病毒特异性探针是Taqman探针。在另一优选例中，所述方法还包括步骤在聚合酶链式反应过程中或之后，检测诺沃克病毒特异性探针发出的荧光信号。在本专利技术的第二方面，提供了一种检测试剂盒，它含有以下试剂(a)扩增诺沃克病毒的特异性引物对，并且所述引物扩增出的扩增产物具有诺沃克病毒ORF1和ORF2的连接区；(b)诺沃克病毒特异性探针。在另一优选例中，所述的扩增诺沃克病毒的特异性引物对选自下组引物15’-GATGAGRTTYTCWGAYYTVAGCAC-3’，SEQ ID NO1引物25’-GATGAGRTTYTCWGAYYTVAGCAC-3’，SEQ ID NO2。在另一优选例中，所述的诺沃克病毒特异性探针具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。在另一优选例中，所述的诺沃克病毒特异性探针是Taqman探针。附图说明图1牡蛎中诺沃克病毒的实时荧光RT-PCR检测结果。其中，从上至下各曲线分别为(a)加入含有诺沃克病毒样品原液的牡蛎，10ul RNA溶液；(b)加入含有诺沃克病毒样品原液的牡蛎，20ul RNA溶液；(c)未加入含有诺沃克病毒粪便的牡蛎；(d)空白对照。图2显示了引物NLV-F/NLV-R和探针NLV浓度梯度实时PCR。其中，曲线自左到右对应的质粒拷贝数分别为3.521×108；3.521×107；3.521×106；3.521×105；3.521×104；3.521×103；3.521×102；3.521×101。图3显示了Ct值与模板拷贝数之间的线性关系。具体实施例方式本专利技术人经过对诺沃克病毒的各种基因序列的广泛而深入的研究，认为诺沃克病毒的ORF1和ORF2区的连接区序列特别适合用于检测和鉴定诺沃克病毒。针对该区域不仅可以设计出特异性扩增诺沃克病毒的引物，还可设计出诺沃克病毒特异性探针。这样，在一次PCR反应中，通过检测TaqMan探针的荧光信号，就可快速简便地鉴定诺沃克病毒。如本文所用，术语“诺沃克病毒特异性探针”指这样的引物(对)，它扩增出的扩增产物具有诺沃克病毒ORF1和ORF2的连接区。一种优选的引物对具有SEQ ID NO1和2所示的序列。如本文所用，术语“诺沃克病毒特异性探针”指能够结合于诺沃克病毒的扩增产物，但不结合于其他病毒(如)的扩增产物的探针。更佳地，所述的诺沃克病毒特异性探针特异性结合于诺沃克病毒的ORF1和ORF2区的连接区。一种优选的探针具有SEQ ID NO3所示的序列。实时荧光PCR是密闭扩增检测方法，扩增体系加样完毕后，即可进行扩增和检测，不需扩增后再进行分析；不仅减少环境污染的可能性，还由于有引物对与探针共同杂交，比普通PCR特异性更高。TaqMan聚合酶链反应技术利用Taq酶5′→3′外切酶活性，在延伸的过程中实现对杂交探针的切断，消除探针3′端荧光基团对5′端标记报告荧光基团信号的淬灭作用。荧光信号的强弱与PCR产物的数量呈正比，检测系统通过检测荧光可推测PCR产物的数量。本专利技术方法中优选的扩增区域为诺沃克病毒的ORF1和ORF2的连接区序列，该区域是诺沃克病毒特有的，可用于检测诺沃克病毒。根据本专利技术的教导，本领域技术人员将能够设计和合成引物以及诺沃克病毒特异性探针，并用于常规的荧光实时PCR和TaqMan聚合酶链反应等检测技术。在本专利技术中，除了检测所针对的靶序列与现有技术不同之外，诸如从样品总抽提DNA、引物的标记、PCR扩增和荧光检测等步骤的条件都与现有技术相同，本领域技术人员完全可以用常规的条件进行上述各种步骤。在本专利技术的优选实施例中，电泳结果表明，扩增诺沃克病毒的特异性引物对能对诺沃克病毒的核酸进行扩增。实时荧光检测结果表明，仅在含诺沃克病毒的标本表现阳性，达到了预期的效果。这表明，通过合理选择出的诺沃克病毒特异性探针是极为有效和特异的。使用定量PCR仪进行实时荧光检测时，根据荧光标记物(FAM、TET)的不同，可在530nm或640nm等波长检测。在优选例中，宜采用具备波长分辩能力的检测仪，并可用常规方法或，采用仪器自配软件进行数据处理和分析。扩增产物在用常规方法进行凝胶电泳，常规紫外检测并拍照。本专利技术的主要优点在于(1)可简便、快速地检测和鉴定诺沃克病毒。(2)基于ORF1和ORF2连接区的引物对可有效地特异性扩增诺沃克病毒的核酸序列，而诺沃克病毒特异性探针则可更特异性地区分诺沃克病毒和其他病毒。(3)检测结果线性好，可用于定量分析。下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1一、实验材料和方法1 菌株来源含有病毒的粪便样品诺沃克病毒毒株32695，35616，35617，HuCV，札幌病毒(Sapporo virus)，均购自中国预防医学科学院病毒所。2 供试贝类牡蛎、淡水河贝，均购自上海水产品市场。3 试剂3.1 1mol/L Tris·Cl缓冲液，pH7.5称取121.1g三羟甲基氨基甲烷(Tr本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种聚合酶链式反应方法，其特征在于，它包括步骤：在聚合酶反应体系中进行聚合酶链式反应，所述的反应体系中含有扩增诺沃克病毒的特异性引物对和诺沃克病毒特异性探针，并且所述引物扩增出的扩增产物具有诺沃克病毒ＯＲＦ１和ＯＲＦ２的连接区。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：潘良文，李晓虹，张舒亚，严罗美，
申请(专利权)人：潘良文，李晓虹，张舒亚，严罗美，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]