畜禽疫病、药物残留自身红细胞凝集快速检测法制造技术

本发明专利技术涉及畜禽全血中病原体、残留药物的检测方法，属疾病诊断领域和食品安全检测领域中畜禽病原体、残留药物的自身红细胞凝集检测法。通过基因工程方法或化学偶联方法将畜禽病原体抗原、病原体抗体、药物抗体与畜禽红细胞单链抗体或畜禽红细胞单克隆抗体进行偶联，得到一种既能与红细胞结合又能与病原体抗体、病原体抗原、残留药物结合的双功能试剂，该双功能试剂以畜禽自身的外周血红细胞为指示物，来检测畜禽体内病原体及残留药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及畜禽全血中病原体、病原体抗原、病原体抗体、残留药物的检测方法，属疾病诊断领域和食品安全检测领域中畜禽病病原体、病原体抗原、病原体抗体、残留药物的自身红细胞凝集检测法。
技术介绍
红细胞凝集试验又称血凝试验，是一种以红细胞作为反应指示物的免疫测定技术，这种由来已久的免疫学方法因其操作简便，不需仪器设备而广泛应用于基层医院，但因其灵敏度问题逐步被淘汰。1988年，澳大利亚学者将人红细胞单克隆抗体的Fab’片段与HIV合成肽抗原偶联，得到了一种双功能化学交联物，建立了一种称为自身红细胞凝集试验的检测方法，该检测方法以患者自身的外周血红细胞为指示物，检测人外周血HIV抗体，其灵敏度和特异性类似于ELISA，整个检测过程仅需2分钟，是一种非常简单方便的快速免疫测定技术。近年，Lalley等应用分子生物学技术制备出含重组红细胞单链抗体的双功能试剂。其方法是将红细胞单链抗体基因与HIV-1的gp41基因融合，构建重组质粒，重组质粒转化大肠杆菌，诱导表达后产生双功能试剂。该双功能试剂由红细胞膜蛋白抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)组成，其间由linker相连，在轻链可变区末端连有gp41。自身红细胞凝集试验与一般间接血凝试验不同之处为反应中的红细胞是未经致敏的受检者新鲜红细胞。主要试剂材料为人红细胞的单克隆抗体，这种抗体能与所有血型的红细胞结合，但不引起凝集反应。这种抗体与另一特异性抗体连接形成的双功能抗体可用于检测标本中的抗原；如与特异性抗原连接，则可用于检测标本中的抗体。反应中的标本为受检者的全血。检测时，将一滴全血滴于一凹面玻璃板上，然后加入一滴双功能试剂，轻轻振摇2分钟后观察是否出现红细胞凝集。自身红细胞凝集试验不仅可以用来检测大分子蛋白(如抗原抗体)，还可以用来检测药物等小分子，如动物体的残留药物，但要以凝集抑制试验的方式动物全血在加入红细胞单抗与特定小分子抗体的双功能试剂后，如血中存在有相应的小分子，它们将会与双功能试剂反应，但并不出现红细胞凝集，因为小分子只能与一分子抗体结合而无法出现交联现象。此时，加入载体蛋白-小分子结合物，由于双功能试剂中小分子抗体的结合部位已被该动物血中游离小分子所占据，则不出现凝集反应，如该动物血中无待测小分子，在加入的载体蛋白--小分子后则有交联现象，出现红细胞凝集；所以用于小分子测定的方法称为自身红细胞凝集抑制试验，出现红细胞凝集为阴性，反之则为阳性。某些血液病如再生障碍性贫血、镰刀形红细胞贫血、球形红细胞血症以及血色素症等所致的红细胞异常，均不影响自身红细胞凝集检测法的应用。理论上，只要动物红细胞上特异抗原不致因患病而丧失，就不会影响自身红细胞凝集检测法测定。自身红细胞凝集检测具有简单、快速、安全的特点，与以往常用的凝集试验相比，它无需分离血清或血浆，血清(可能含有致病因子而具有传染性)分离过程中对实验操作人员可能存在的传染危险性也可排除。目前，国内非常缺乏科学简便、易于推广普及的畜禽诊断技术，大部分基层(甚至包括一些县、市级业务部门)动物疫病防治单位缺乏必要的检测手段，导致畜禽疾病的传播难以控制，同时疾病的非典型化、多种病原的混合感染使畜禽疾病疫情复杂，诊断更加困难，靠一把剪子，一双眼睛来诊断各种畜禽传染病很容易贻误治疗时机。由于疫病不能及时检测与确诊，免疫接种也带有极大的盲目性和投机性，造成多种畜禽传染病免疫失败。随着防疫意识的加强，人们必定会在引种、畜禽商品流通及制定合理的免疫计划时加强病原的及时检测，因此快速、敏感、特异、价廉且适合基层使用的商品化疾病诊断试剂的需求量将会越来越大。我国畜禽疾病诊断技术近几年发展较快，很多研究单位研究出不同的诊断试剂(盒)，如扬州大学的新城疫强毒快速ELISA诊断试剂盒、沙门氏ELISA-PCR联合检测试剂盒以及H5、H9亚型禽流感病毒多重RT-PCR快速检测试剂盒等；河南农科院的IBD胶体金诊断试剂盒；中国农业大学动物医学院的淋巴白血病ELISA诊断试剂、北京市农林科学院畜牧兽医研究所的传染性鼻炎ELISA诊断试剂等。但这些试剂(盒)因实验条件和价格的原因，难以满足基层现场快速检测的要求。目前，我国食品安全方面也存在两大主要问题一是微生物污染仍然是影响我国食品卫生和安全的最主要因素，致病微生物引发的食品污染严重损害了人们的健康，控制致病微生物污染仍然是目前解决食品污染问题的主要内容；二是种植、养殖等源头污染严重影响食品安全。农药、兽药(尤其是抗生素、激素)和禁止使用的饲料添加剂的滥用和残留是造成食品源头污染的主要原因。但是，目前对这些目标物的检测主要集中在有条件的实验室，需要高压液相色谱、PCR仪、酶标仪等仪器设备，人员也需要进行培训，基层单位很难做到这些。自身红细胞凝集检测法因其操作简便，不需仪器设备，可广泛应用于基层。根据我国现有研究基础，利用免疫学、血清学方法生产畜禽疾病和动物体药物残留的商品化自身红细胞凝集诊断盒因其快速、简便、准确、敏感、价廉的特点将有广阔的市场前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是用基因工程或化学偶联的方法将各种畜禽动物红细胞单克隆抗体和抗原、抗体结合在一起形成双功能试剂，从而制造出一类具有安全、快速、准确、价廉特点的检测试剂。该类试剂无需分离血清、无需仪器设备，利用待测全血标本中的自身红细胞作为指示系统，仅需一滴全血便可在2分钟内快速检测病原体及其抗体、残留药物、疫苗抗体。本专利技术是这样实现的首先利用抗体制备技术得到高效价、高特异性的畜禽动物血红细胞单克隆抗体、小分子药物抗体、病原体及疫苗的抗体，并用蛋白酶和巯基类试剂将血红细胞单克隆抗体修饰成Fab’片段；其次利用基因工程技术表达病原体抗原或生化技术纯化病原体抗原，再次，在戊二醛或其他试剂的作用下将红细胞单抗Fab’片段同病原体抗原、病原体抗体、疫苗抗体、小分子药物的抗体偶联，得到一类既能和畜禽动物红细胞相结合又能和病原体抗原、小分子药物、病原体抗体、疫苗抗体、小分子药物抗体结合的双功能试剂。检测时将一滴待测动物的全血置于一凹面玻璃板上，然后加入一滴双功能试剂，轻轻振摇，2分钟后，观察红细胞是否出现凝集，再判定结果。残留药物的检测是这样实现的如动物血中存在有相应的小分子，它们将会与双功能试剂反应，但并不出现红细胞凝集，因为小分子只能与一分子抗体结合而无法出现交联现象。此时，加入载体蛋白-小分子结合物，由于双功能试剂中小分子抗体的结合部位已被该动物血中游离小分子所占据，则不出现凝集反应，如该动物血中无待测小分子，因后加入的载体蛋白-小分子的交联作用则出现红细胞凝集，所以用于小分子测定的方法称为自身红细胞凝集抑制试验，出现红细胞凝集为阴性，反之则为阳性。病原体及其抗体检测、免疫效果检测是这样实现的如动物血中有相应病原体及其抗体，它们将会与双功能试剂反应，出现交联现象，使红细胞凝集，出现红细胞凝集判为阳性，反之则判为阴性。本专利技术的积极效果一、简便快速使用本专利技术制备的检测试剂，可以检测畜禽疫病、免疫效果及动物体药物残留，其灵敏度和特异性类似于ELISA，整个检测过程仅需2分钟，是一种极为简单方便的快速免疫测定技术。二、特异性强由于采用病原体基因工程抗原或多肽抗原与抗红细胞单克隆抗体相偶联，间接ELISA一些不可避免的非特异性标本绝大本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种畜禽疫病、残留药物红细胞凝集检测方法，其特征为：用基因工程或化学偶联的方法将各种畜禽动物红细胞单克隆抗体和病原体或病原体抗原或病原体抗体或残留药物抗体结合在一起，形成双功能试剂，以畜禽待测全血标本中的自身红细胞作为指示系统，直接检测全血标本中病原体、病原体的抗原、病原体的抗体、残留药物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李晨阳，李玉林，陈小科，
申请(专利权)人：河南省生物工程技术研究中心，
类型：发明
国别省市：41[中国|河南]