本发明专利技术涉及同时测定血液（血浆、血清、红细胞）、组织（心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、膀胱）中马兜铃酸及马兜铃内酰胺类成分的高效液相色谱方法，其特点为样品经盐酸酸化后经乙酸乙酯提取，采用配备二极管阵列检测器的高效液相色谱仪和十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相为１％冰醋酸／３０ｍｍｏｌ.Ｌ↑［－１］三乙胺－乙腈梯度洗脱，柱温１５℃，检测波长分别为２５０ｎｍ（马兜铃酸类成分）、２６０ｎｍ（马兜铃内酰胺类成分）。该方法中所述的血液包括人、大鼠、小鼠、兔子等；组织包括大鼠、小鼠、兔子等。该方法能很好地将样品中的被测成分与内源性物质有效的分开，从而测定其各自的含量，具有灵敏度高、专属性强，分析结果重现性良好的特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及同时测定血液(血浆、血清、红细胞)、组织(心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、膀胱)中马兜铃酸及其内酰胺类成分的高效液相色谱方法。
技术介绍
马兜铃酸I、II(aristolochic acid I，AA-I；aristolochic acid II，AA-II)是马兜铃属植物含有的主要活性成分，同时也是有毒成分，AA-I、AA-II的体内主要代谢产物为马兜铃内酰胺I、II(aristololactam I，AL-I；aristololactam II，AL-II)。由于“马兜铃酸肾病”(Aristolochic AcidNephrophathy，AAN)的报道，此类成分的体内的含量检测研究成为重要任务。马兜铃酸类化合物在体内分布的分析检测方法前人有一些报道。检测AA-I、II的方法有纸色谱-分光光度法(K.Hideg，Olga H.Hankovszky，J.Méhes.Estimation of aristolochic acid and some of its derivatives bypaper chromatography and spectrophotometry in body fluids，Acta Physiologica，1963，2379-84)、紫外分光光度法(相正心，何兴全，周桂芬，等.马兜铃酸含量的紫外分光光度测定法及药代动力学研究.药学学报，1984，19(3)224～227)、气相色谱法(赖普辉，姜贵吉，裴文.马兜铃酸-A的制取及其衍生物的合成.化学通报，1990，(1)33～35)以及同位素标记法(苏涛，屈磊，张春丽，等.马兜铃酸I在大鼠体内的代谢特征研究.中国中药杂志.2004，29(7)676-681)等；马兜铃内酰胺类化合物的检测，有高效液相色谱-荧光法测定尿及粪便中的AL-I、AL-II、AL-Ia(G.Krumbiegel，et al.Studies on the metabolism of aristolochic acids I and II，Xenobiotica，1987，17(8)981-991)，及测定人尿中的AL-I、AL-II(Schulz M，Weist F，Gemahlich M.Dunnschichtchromatographischer Nachweis der Aristolochia-Saure inverschiedenen Korperflussigkeiten.Arznein Forsch，1971，21934～936)报道，但是尚无对血液、组织中的AAs和ALs同时进行检测的报道。目前仅有本课题组的一项专利技术专利(申请号200410033845.7)提供了血浆中同时测定马兜铃酸I、II和马兜铃内酰胺I、II的高效液相色谱方法，但未见红细胞中该类成分测定的报道，也未见组织中马兜铃内酰胺类成分测定的报道，而仅见组织中马兜铃酸类成分测定的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对以上存在的问题，提供一种同时测定血液(血浆、血清、红细胞)和组织(心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、膀胱等)中马兜铃酸类及马兜铃内酰胺类化合物的高效液相色谱方法。采用以下措施来实现上述专利技术目的。以血浆中同时测定马兜铃酸I、II和马兜铃内酰胺I、II的高效液相色谱方法为基础，通过对血浆、红细胞、组织(心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、膀胱)样品进行盐酸酸化、乙酸乙酯提取预处理后，采用高效液相色谱仪分析。包括含有配备二极管阵列检测器的高效液相色谱仪和十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相为1％冰醋酸/30mmol·L-1三乙胺-乙腈梯度洗脱，检测波长分别为250nm(马兜铃酸)、260nm(马兜铃内酰胺)。本专利技术包括生物样品预处理方法和分析测定方法2方面内容。1、样品的预处理(1)血浆样品预处理吸取0.5～1.0ml血浆于离心管中，加入5mol·L-1的盐酸5～10μl，涡旋混合1min，室温(20℃)水浴45min，加入3ml乙酸乙酯，涡旋混合1min，取上清；下层再加入3ml乙酸乙酯，涡旋混合1min，4000转/分，离心2min，取上清液，合并两次上清液。40℃水浴，N2挥干，150μl甲醇溶解残渣，过滤，4℃保存，留待进样。(2)红细胞样品预处理吸取0.5ml红细胞于离心管中，加入0.5ml的蒸馏水，涡旋混合1min，室温(20℃)下静置30min。红细胞破裂溶解后，同“血浆样品制备”项下“加入5mol·L-1的盐酸10μl”起操作。(3)组织样品预处理称取适量组织样品(心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、膀胱)，按照每克组织样品加入4ml生理盐水的比例，制备组织匀浆液。其中，心、脾、肺采用整个组织，用眼科剪剪碎后，加入匀浆液匀浆；肝组织每次均取方叶部分称重后剪碎匀浆；肾脏取右肾下半部分，剪碎后匀浆；脑组织直接匀浆即可；胃、膀胱将组织里面翻过来，将其内容物清洗干净，剪碎后匀浆；膀胱由于较小，不进行分别测定，而是将一组大鼠的膀胱分别清洗后放在一起匀浆、测定。吸取1ml组织匀浆液于离心管中，同“血浆样品制备”项下“加入5mol·L-1的盐酸10μl”起操作。2.前项专利技术样品预处理条件的考察本专利技术采用含马兜铃酸类及马兜铃内酰胺类成分的人血浆样品酸化后以乙酸乙酯进行萃取的预处理方法。针对影响马兜铃酸及马兜铃内酰胺类成分提取回收率的影响因素，如萃取溶剂用量、加入盐酸浓度等进行了筛选；同时还设计了正交试验和验证实验对其它操作条件进行了优化，最终获得了对含马兜铃酸及马兜铃内酰胺类成分的人血浆或血清样品均有较高提取回收率(均大于95％)的预处理方法。(1)测定所用色谱条件色谱柱ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)，Agilent公司流动相A∶B＝1％醋酸/30mmol·L-1三乙胺∶乙腈(35％B→100％B)柱温15℃进样体积20μl检测波长260nm(AL-I，AL-II)；250nm(AA-I，AA-II)。人血浆分离色谱图，见说明书附图1。(2)萃取溶剂用量的确定-20℃保存正常人空白血浆，37℃水浴解冻，分别取1.0ml血浆，加入60μl混和对照品溶液(其中AL-II、AA-II、AL-I、AA-I的浓度分别为9.80、10.1、10.3、6.60μg·ml-1)，涡旋混匀1min，加入5mol·L-1盐酸溶液10μl，涡旋混匀1min，40℃水浴30min，放冷至室温，分别采用乙酸乙酯3ml萃取一次；5ml萃取一次；6ml分二次加入(3ml，3ml)萃取后合并上清液；7ml分三次加入(3ml，3ml，1ml)萃取后合并上清液。萃取后的上清液分别在40℃水浴N2挥干(约40～60min)，加入150μl甲醇溶解，过滤(0.45μm)。4℃保存。进样体积20μl。结果见表1，从表中可以看出分别采用3ml、5ml萃取一次4种成分的提取回收率均低于90％，6ml(3ml，3ml)分二次萃取后合并上清液得到的血浆中4种成分提取回收率均较高且接近100％。因此萃取溶剂用量确定为1.0ml血浆加入6ml乙酸乙酯，分二次加入(3ml，3ml)萃取后合并上清液。表1 萃取溶剂不同用量提取后人血浆中4种成分的提取回收率比较 (3)盐酸浓度的确定-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种含马兜铃酸类及马兜铃内酰胺类成分的生物样品的预处理方法，其特征在于：取０．５～１．５ｍｌ生物样品，加入盐酸（每毫升生物样品中盐酸浓度范围在３．０×１０↑［－５］～１．０×１０↑［－４］ｍｏｌ.Ｌ↑［－１］内）后涡旋混匀，室温放置３０～６０ｍｉｎ，然后采用乙酸乙酯萃取１～２次，每次１．５～５．０ｍｌ，涡旋混合萃取，收集上清液，在６０℃以下的水浴上用氮气（Ｎ↓［２］）挥干，加入１５０μｌ甲醇溶解残渣，过滤，供进样做高效液相色谱分析。方法中所述的生物样品来源包括人、大鼠、小鼠和兔子等的血浆样品、血清样品和红细胞溶液样品（吸取等量的红细胞和蒸馏水于离心管中，涡旋混合，静置使红细胞破裂溶解后得到红细胞溶液）以及大鼠、小鼠和兔子等的组织匀浆液样品（称取适量组织样品包括心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、膀胱等，按照每克组织样品加入４ｍｌ生理盐水的比例，制备组织匀浆液）等；方法中所述的马兜铃酸类及马兜铃内酰胺类成分包括马兜铃酸Ⅰ、马兜铃酸Ⅱ、马兜铃内酰胺Ⅰ和马兜铃内酰胺Ⅱ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王璇，许俊羽，李晓玫，高小丽，蔡小青，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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