一种大豆籽粒维生素E的检测方法技术

本发明专利技术属于农业生产技术领域。是一种大豆籽粒维生素Ｅ含量超声萃取、定性定量检测方法。本发明专利技术在传统维生素Ｅ检测方法的基础上，改进了维生素Ｅ的提取方法和液谱检测的流动相等，同时结合大豆籽粒的微量取样方法，实现了单个大豆籽粒维生素Ｅ含量的微量测定，在高维生素Ｅ大豆育种和品种改良上具有极其重要的现实意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于农业生产
是一种大豆籽粒维生素E含量超声萃取、定性定量检测方法。
技术介绍
维生素E是大豆种子中的重要功能性成分之一，其含量与组成随品种和生长环境的不同而存在差异。据报道，作物种子中维生素E不仅是人类获得天然维生素E的重要来源，在对人体防衰老、抗疾病等方面也具有显著作用，故而引起人们广泛的关注。测定种子中的维生素E不仅关系到衡量营养指标，而且关系到资源的开发利用。当代农作物的育种已进人了生化工程时代，依靠正确的生化测定来筛选现有种质资源中品质状况，具有非常重要的现实意义。由于维生素E结构复杂，异构体种类多，分析测定困难，多年来许多科学家致力于其分析测定的研究，取得了很大的进展，主要分析方法包括双波电压法、示波法、薄层色谱法、气相色谱法、紫外分光光度法、荧光分光光度法、高效液相色谱法等。从近年发展看，利用荧光分光光度法测定各类作物中维生素E较多见。它能直观地测出各类作物种子中维生素E的含量，还在于免除了一般分光光度法干扰因素较多、准确性稍差的缺点，又比色谱法步骤简便。可是，目前应用仍不够广泛，主要原因在于试样分离提取时需要通入高纯氨气保护维生素E免受氧化破坏，因而装置复杂，费用较贵。并且，分离提取过程耗时长达16-18小时，使种子中的维生素E难免有所损失，因此在大批量样品的分析测试时，困难较大、经费较多，影响了普遍运用。高效液相色谱法(HPLC)是近三十年迅速发展的一种分离分析技术，用来分析维生素E能极大地简化样品预处理步骤，与其它方法相比具有干扰小，灵敏度高、快速等优点，是目前较为理想的检测技术。但是，该方法目前只能测定大豆油中的维生素E组分含量，而且不能实现单个籽粒维生素E组分含量的检测，在大豆资源筛选和品种改良上仍存在一定的不足。为此，我们针对上述缺陷，对大豆籽粒维生素E提取方法、色谱检测流动相等进行改进，同时结合大豆籽粒的微量取样方法，研究出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术从以上技术背景出发，对大豆籽粒中的维生素E总量进行超声萃取，把得到的四种不同结构的维生素E混合物离心后，取上清液在液相色谱上进行定性和定量检测。具体提取和检测程序如下a.前期准备药品准备80％乙醇；1μg/ml母育酚的80％乙醇溶液；样品准备单个籽粒编号后，用壁纸刀片在豆粒的远脐端多次切取薄薄的碎片(注意不要超过籽粒的1/3)，用天平称取10-12毫克，放入编好号的带盖的塑料试管中；b.维生素E的提取每个样品中加入1ml母育酚乙醇溶液→匀质器混匀10秒→超声波萃取15分钟→室温静止15分钟→匀质器混匀10秒→超声波萃取15分钟→用离心机以13000转/分钟离心15分钟→将上清液移入ep管→用离心机以13000转/分钟离心5分钟→吸取500μl于2ml顶空瓶中，准备分析；c.维生素E的检测高效液相色谱(HPLC)的检测条件用长2m，直径3mm的填充柱，检测波长295nm，柱温40℃；流动相为乙氰和甲醇，分流比为9∶1；流速为0.5ml/min；进样量为30μl；重复次数为3次，检测时间为25-30分钟；维生素E的定性方法根据文献报道的各组分保留时间与实验所得的保留时间判定。在本检测中α、β、γ、δ-维生素E的保留时间分别在18-19、14-15、15-16和12-13分钟之间；维生素E的定量方法本检测采用内标法对各种维生素E组分进行定量，大豆籽粒中各种维生素E组分含量由对应的峰面积与内标物的峰面积的比值求得。本专利技术的优点是可以实现单个籽粒样品(10-12毫克左右)的检测，不影响大豆籽粒的继续生长和发育，可以在资源筛选及品种改良的任意阶段进行鉴定和评价，对高维生素E大豆育种和改良提供了有利的技术支撑。具体实施例方式本专利技术在中国科学院东北地理与农业生态研究所的“大豆功能营养资源拓宽与改良”课题中得到了应用。在课题实施过程中采用本专利技术对200多份东北大豆资源进行了分析和评价，得到了2份α-维生素E和3份总维生素E含量较高的大豆遗传材料，对于本课题的完成和高维生素E大豆育种都起到了有效的技术支撑。下面列出了部分大豆资源籽粒中维生素E含量的检测结果部分大豆资源籽粒中维生素E含量的检测结果(mg/100g) 根据检测结果可以看出，东北大豆资源在维生素E组分含量及总量上都存在很大的遗传变异。比较而言，γ-维生素E和δ-维生素E含量较多，而α-维生素E含量较少，β-维生素E含量更少。这些检测结果与文献报道的基本上是一致的，可见本方法不仅是可行的，而且还在高维生素E大豆育种和改良上具有绝对的优势。权利要求1.一种大豆维生素E的检测方法，其特征在于先对大豆籽粒中的维生素E总量进行超声萃取，再把得到的四种不同结构的维生素E混合物离心后，取上清液在液相色谱以上进行定性和定量检测，提取和检测程序如下a.样品准备单个籽粒编号后，用壁纸刀片在豆粒的远脐端多次切取薄薄的碎片(注意不要超过籽粒的1/3)，用天平称取10-12毫克，放入编好号的带盖塑料试管中；b.维生素E的提取每个样品中加入1ml母育酚乙醇溶液→匀质器混匀10秒→超声波萃取15分钟→室温静止15分钟→匀质器混匀10秒→超声波萃取15分钟→用离心机以13000转/分钟离心15分钟→将上清液移入ep管→用离心机以13000转/分钟离心5分钟→吸取500μl于2ml顶空瓶中，准备分析；c.维生素E的检测高效液相色谱(HPLC)的检测条件用长2m，直径3mm的填充柱，检测波长295nm，柱温40℃；流动相为乙氰和甲醇，分流比为9∶1；流速为0.5ml/min；进样量为30μl；重复次数为3次，检测时间为25-30分钟；在检测中α、β、γ、δ-维生素E的保留时间分别在18-19、14-15、15-16和12-13分钟之间，实现了维生素E的定性检测；本专利技术采用内标法对各种维生素E组分进行定量，大豆籽粒中各种维生素E组分含量由对应的峰面积与内标物的峰面积的比值求得。全文摘要本专利技术属于农业生产
是一种大豆籽粒维生素E含量超声萃取、定性定量检测方法。本专利技术在传统维生素E检测方法的基础上，改进了维生素E的提取方法和液谱检测的流动相等，同时结合大豆籽粒的微量取样方法，实现了单个大豆籽粒维生素E含量的微量测定，在高维生素E大豆育种和品种改良上具有极其重要的现实意义。文档编号G01N30/06GK1987450SQ20061016327公开日2007年6月27日 申请日期2006年12月18日 优先权日2006年12月18日专利技术者潘相文, 王国栋, 李艳华, 兰志华, 梁桂荣, 邢海军, 张士春 申请人:中国科学院东北地理与农业生态研究所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大豆维生素Ｅ的检测方法，其特征在于先对大豆籽粒中的维生素Ｅ总量进行超声萃取，再把得到的四种不同结构的维生素Ｅ混合物离心后，取上清液在液相色谱以上进行定性和定量检测，提取和检测程序如下：ａ．样品准备单个籽粒编号后，用壁纸刀 片在豆粒的远脐端多次切取薄薄的碎片（注意不要超过籽粒的１／３），用天平称取１０－１２毫克，放入编好号的带盖塑料试管中；ｂ．维生素Ｅ的提取每个样品中加入１ｍｌ母育酚乙醇溶液→匀质器混匀１０秒→超声波萃取１５分钟→室温静止１５分 钟→匀质器混匀１０秒→超声波萃取１５分钟→用离心机以１３０００转／分钟离心１５分钟→将上清液移入ｅｐ管→用离心机以１３０００转／分钟离心５分钟→吸取５００μｌ于２ｍｌ顶空瓶中，准备分析；ｃ．维生素Ｅ的检测高效液相色谱（ＨＰＬ Ｃ）的检测条件：用长２ｍ，直径３ｍｍ的填充柱，检测波长２９５ｎｍ，柱温４０℃；流动相为乙氰和甲醇，分流比为９∶１；流速为０．５ｍｌ／ｍｉｎ；进样量为３０μｌ；重复次数为３次，检测时间为２５－３０分钟；在检测中α、β、γ、δ－维生素Ｅ的保留时间分别在１８－１９、１４－１５、１５－１６和１２－１３分钟之间，实现了维生素Ｅ的定性检测；本专利技术采用内标法对各种维生素Ｅ组分进行定量，大豆籽粒中各种维生素Ｅ组分含量由对应的峰面积与内标物的峰面积的比值求得。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：潘相文，王国栋，李艳华，兰志华，梁桂荣，邢海军，张士春，
申请(专利权)人：中国科学院东北地理与农业生态研究所，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]