改变微球表面特性的方法技术

提供了形成染色微球的各种方法。一种方法包括利用热或光活化与染料偶联的化学结构，在微球存在下形成反应中间体。反应中间体通过共价键连接到微球的聚合物上，由此将染料偶联到聚合物上，形成染色的微球。还提供了形成与一个分子偶联的染色微球的其他方法。这些方法包括如上所述给微球染色，然后在染色微球外表面上合成分子。还提供了染色微球群。染色微球群中的每个染色微球包含一种染料，该染料通过一种化学结构连接到每个染色微球的聚合物上。染色微球群的染色特性由染料引起的差异因数约小于１０％。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术总体上涉及。某些实施方式包括将烯醇酸偶联到微球上，对微球表面特性进行改性，这样就能通过烯醇酸将一种试剂偶联到微球上。相关技术介绍以下描述和实施例并不因为包括在本部分中，而被看作是现有技术。分光光谱技术广泛应用于化学体系和生物体系分析中。多数情况下，这些技术涉及对目标物吸收或发射电磁辐射的测定。一种这样的应用是用于微阵列领域，它是一种被许多学科采用的技术，包括组合化学和生物检测行业。美国德克萨斯州，Austin的Luminex公司开发出一种系统，该系统可在各种着色的荧光微球表面上进行生物检测。这种系统的一个实例见述于Chandler等的美国专利第5981180号，该专利全文参考结合于本文。在这样的流体流动器件中，利用激光激发微球，当各单独的微球以较高速度通过检测区时，对其进行荧光检测。这种系统生成的测量数据可以很容易地传送到数据库中，用于进一步分析。一些研究小组和个人也报道了对荧光微球进行多元分析的检测工作，见述于Fulton等，Clin.Chem.，1997，43，1749-1756；Kettman等，Cytometry，1998，33，234-243；McDade等，Med.Dev.Diag.Indust.，1997，19(4)，75-82；McHugh，Methods Cell Biol.，1994，42，575-595；Nikiforov等，NucleicAcid Res.，1994，22，4167-4175；Fulton的美国专利5736330，Chandler的美国专利6046807；Fulton的美国专利6057107；Chandler的美国专利6139800；Chandler等的美国专利6268222；Chandler的美国专利6366354；Chandler的美国专利6411904；Chandler等的美国专利6449562，这些文献都全文参考结合于本文中。在上述系统中，荧光染料被吸收到微球中和/或结合到微球的表面。染料根据其在该系统选定的检测窗的波长范围内的发光能力进行选择。另外，各检测窗相隔一定的波长，选择的染料要尽可能减少染料荧光信号在相邻检测窗内的重叠。采用两个检测窗和两种染料，每种染料有10个不同的浓度，那么将有100种可通过荧光区分的微球搭配。过去30年中，由于亲合色谱、固相合成和生物大分子(如蛋白质、寡聚核苷酸等)固定的领域的进步，它们已经进入基于微球的生物医学应用。例如，可将一个或多个生物分子连接到微球表面上。所述一个或多个生物分子根据要进行的具体检测形式进行选择。例如，一个微球群可包括不同子群的微球，每个子群与不同的抗原偶联。子群可与样品结合，然后可以通过检测来确定样品中存在哪些抗原。与微球相结合的生物分子可包括本领域已知的任何生物分子。通过偶联可以达到生物分子或其他任何此类实体的固定，偶联方式包括微球表面上的活性/稳定反应基团与待固定实体上的特定官能团之间发生的以下作用(1)离子相互作用；(2)吸附；(3)络合(例如“金属配位”的偶联)；(4)共价键。例如，微粒和微滴定板是许多固定系统中常用的固体基质。为确保能固定生物材料以进行足够灵敏的化验，制备并维持固体的官能化活性表面是很重要的。在固体表面上固定生物分子的现有方法通常涉及固体表面上的活化羧基、氨基、羟基或硫羟基与生物分子的反应。这些基团活化之后或引入官能化间隔基之后，活化的基团在固体表面上提供了直接连接生物分子的位置。但是，当前用来提供直接连接位的基团有许多缺陷。例如，这些官能团中大多数官能团在水性环境中容易发生水解，在不到1小时的时间就失去反应活性(即不具有化学活性)。因此，如果用这些官能团将生物分子连接到固体表面，它们可能在数量、可重复性和均匀性方面随着时间出现不利的变化。活性微球或官能化微球一般通过对已经适当官能化的单体进行共聚或通过对预形成的微球进行化学改性来产生。后官能化是制备活性微粒的流行方法，如Upson早期在J.Polym.Sci.Polym.Symp.(1985，72，45)上所述，该文献全文参考结合于本文。几个研究小组报道了制备和评价各种通过改性制得的微粒的近期工作，包括Margel等J.Polym.Sci.1991，A-29，347-355；Anal.Biochem.，1981，128，342-350)、Ugelstad等(Makromol.Chem.，1979，180，737-744；Adv.ColloidInterface Sci.，1980，13，102-140)和Rembaum等(Br.Polym.J.，1978，10，275-280；J. Macromol.Sci.Chem.，1979，A-13，603-632)，它们全文参考结合于本文。R.Arshady在Biomaterials，1993，14，5-15中的一篇综述介绍了经过标记的活性微球的合成与物理化学性质，该文献全文参考结合于本文。Fray等，Bioconjugate Chem.，1999，10，562-571报道了用耐水解的醛官能团预活化微粒的策略，但观察到这些微球的反应产率小于8％，该文献全文参考结合于本文。Milton的美国专利6146833介绍了酰基氟活化的聚合物表面与氨基衍生的生物分子在室温的反应。Clerc等在国际公开专利WO 99/67228中介绍了氟苯基树脂在固相合成酰胺、肽、羟氨酸、胺、氨基甲酸酯、碳酸酯、磺酰胺和α取代羰基化合物中的应用，这些文献全文参考于本文。Medvedkin等，Bioorg.Khirn.，1995，21(9)，684-690介绍了在肽的合成中使用经磺基-四氟苯基活化的酯，并证实了它们的反应活性和在水性存放条件下良好的稳定性，该文献全文参考结合于本文。显然，用这种试剂预活化聚苯乙烯表面还没有见诸报道。1950年，Hoechst在Heyna等人的德国专利第DE 960534中提出用乙烯基砜(VS)改性的活性染料对纤维素和羊毛纤维染色，该文献全文参考结合于本文。Siegel在一篇综述中完整描述了基于VS及其受保护的2-硫酸根合乙基砜和2-硫代硫酸根合乙基砜的活性染料。Snow等人的美国专利第5414135号描述了用PEG负载的VS对蛋白质进行改性，该文献全文参考结合于本文。将生物分子(如寡聚核苷酸、蛋白质和碳水化合物)固定到荧光微球上的最常用方法是活化存在于微球表面的羧基。该活化需要过量的N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)以及4-6的偶联pH值。碳二亚胺与羧基官能团之间的反应形成了活化的O-酰基脲衍生物反应中间体。然后，该反应中间体受到与微球相连的生物分子上的氨基中的伯氮的亲核进攻，释放出取代的脲，并产生在反应中间体与生物分子之间的酰胺连接。但是，这样活化羧基具有许多缺点。例如，反应中间体的半衰期极短，快速发生水解或重排产生N-酰基脲加合物。此外，形成O-酰基脲的最佳pH是4-5。不过，核苷酸上的伯氨基主要在约4-5的pH值下发生质子化，因此很不活泼。反应中间体的这些限制严重妨碍了生物分子与微球的偶联产率。此外，在低pH值下，生物分子中的核酸碱基可能发生严重的质子化。这种质子化引起DNA解链，暴露出螺旋上的疏水核，促使螺旋与微球的固体基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种改变微球表面特性的方法，该方法包括将烯醇酸偶联到微球上，来改变微球的表面特性，其中，可通过烯醇酸将试剂与微球偶联。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：AG鲁加德，KD霍法克，
申请(专利权)人：卢米尼克斯股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]