水产病原菌群体感应信号分子的检测方法及其专用试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种水产病原菌群体感应信号分子的检测方法及其专用试剂盒。该方法，包括将受试菌进行如下实验：１）与根癌农杆菌Ａ１３６在添加了Ｘ－Ｇａｌ或ＯＮＰＧ的平板上共同划线培养，观察是否显示蓝色；２）与紫色杆菌ＣＶ０２６在同一平板上划线培养，观察是否显示紫色；３）将受试菌划线接种于含５００ｎＭ　　Ｎ－酰化高丝氨酸内酯的ＬＢ平板上培养，再将紫色杆菌ＣＶ０２６分别在受试菌划线旁平行划线，观察是否显示紫色变浅或褪去；４）与Ｅｓｃ．ｃｏｌｉ　　ｐＳＢ４０３在平板上共同划线培养，观察是否发光；上述实验中，如果至少有一项实验显示阳性，则受试菌产生Ｎ－酰化高丝氨酸内酯。本发明专利技术方法准确率高，没有假阴性现象，易于定性定量分析，操作简便，成本低，获得结果迅速，适合大规模高效率检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种水产革兰氏阴性病原菌群体感应信号分子的快速检测方法及其专用试剂盒。
技术介绍
我国每年由细菌性病害所导致的水产养殖经济损失高达500亿元，水产病原菌主要为革兰氏阴性菌(姜兰，等.中国水产科学.9(2)152-156，2002)，常见的包括Vibrio anguillarum、Aeromonas salmonicida、Aeromonas hydrophila、Yersiniaruckeri、Vibrio salmonicida、Vibrio vulnificus、Aeromonas salmonicida及Vibrio splendidus等(Jesper B.B.et al.Dis Aquat Org.6543-52，2005)，这些病原菌均与水环境相关，与目前研究较多的植物性病原菌应区别开来(高轶静，南京农业大学硕士学位论文，中慢生华葵根瘤菌的群体感应系统对其生长和共生结瘤的影响，2006)。常规化学药剂及抗生素的使用由于存在环境污染、食品安全隐患、诱导耐药菌株等风险，水产养殖实践中迫切需要开发新的防治途径与药物。1994年，Fuqua等首次提出“群体感应(quorum sensing，简写QS)”一词来描述细菌细胞特定形式的分子通讯，即细菌产生信号分子并释放到环境中去，当环境中的信号分子达到一定的浓度后诱导细胞密度信赖的特定基因的表达，从而展现出新的行为特征(Fuqua W.G.et al.，Journal of Bacteriology.176269-275，1994)。由信号分子介导的细胞-细胞间信号可调节细菌的许多功能，如抗生素的生物合成、毒性因子的产生、质粒结合转移等(陈峰.上海农业学报.21(1)98-102，2005)，因此，群体感应途径成为了生物防治和治疗细菌性病害的新突破口，为解决目前因传统抗生素的滥用而日趋严重的耐药性问题提供了新的靶点(Lars R.et al.Journalof Microbiological Methods.44239-251，2001)，也是目前国际上的热点研究议题。例如通过合成一些群体感应信号分子结构类似物，与相应的受体蛋白竞争性结合，如海洋红藻(Delisea pulchra)能够产生一种和信号分子(N-酰化高丝氨酸内酯)结构类似的卤化呋喃酮(halogenated furanones)，将此物质与费氏弧菌V.fischeri一起培养会促进LuxR(一种信号分子受体蛋白)的降解，并因此破坏其QS行为(Haviv Y.S.et al.Cancer Res.62(15)4273-4281，2002)，从而达到病害控制的目的。对革兰氏阴性(G-)菌而言，大多数的这类信号分子都属于N-酰化高丝氨酸内酯(Acylated Homoserine Lactone，AHL)，其结构含有高丝氨酸内酯环和4-14个碳的酰基侧链，侧链的第三个碳原子被氧或羟基取代，或者是没有被取代，换言之，它们之间的主要区别在于N-侧链的长度，或3-碳位置的取代基的不同，或侧链中有无一个或多个不饱和键(Camara M.et al.Methods in Microbiol.27319-330，1998)。对于AHLs的检测与鉴定，是通过群体感应途径进行水产病原菌控制研究的基础。由于群体感应信号分子的浓度极低，一般手段无法检测出来。近年来采用了对扩散性信号分子敏感的微生物作为生物检测菌，使得对信号分子的快速生物检测成为可能。多数用于生物检测的菌是无法自身合成AHL的突变株，而当有外源AHL加入后才能表现出野生型的表型(陈峰.上海农业学报.21(1)98-102，2005)。然而，已发表的生物报告系统比较单一(詹克航，等.中华医学杂志.86(37)2655-2658，2006)，在检测范围与准确率上均存在一定限制，并且会出现假阴性的报道(杨梦华，等.微生物学报.46(6)1007-1010，2006)。有关水产革兰氏阴性病原菌群体感应信号分子的鉴定尚未见报道。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术的目的是提供一种水产革兰氏阴性病原菌群体感应信号分子的快速检测方法及其专用试剂盒。本专利技术提供的水产革兰氏阴性病原菌群体感应信号分子的快速检测试剂盒，包括根癌农杆菌(Agrobac terium tumefaciens)A136、紫色杆菌(Chromobac terlerviolaceum)CV026、N-酰化高丝氨酸内酯、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)或邻硝基酚β-D-半乳糖苷(ONPG)、和大肠杆菌(Escherichia coli)pSB403。为了使所述试剂盒的检测结果更加准确可信，所述试剂盒还包括阳性对照菌株液化沙雷氏菌(Serratia Liquefaciens)MG1、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)PA01和费氏弧菌(Vibrio fischeri)MJ1。所述N-酰化高丝氨酸内酯可为3-OH-C6-HSL、3-OH-C8-HSL、3-OH-C10-HSL、3-Oxo-C10-HSL、C8-HSL、3-Oxo-C8-HSL、3-Oxo-C12-HSL、3-Hydroxy-7-C14-HSL、C4-HSL、3-Hydroxy-C4-HSL和3-OH-C12-HSL(3-羧基十二碳-N-1-高丝氨酸内酯，OHHL)中的一种或一种以上任意组合。本专利技术提供的革兰氏阴性病原菌产群体感应信号分子的快速检测方法，包括将受试菌进行如下所述四项实验1)将所述受试菌与报告菌株根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)A136在同一添加了X-Gal或ONPG的固体平板上共同划线培养，观察根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)A136菌体是否显示蓝色，如果显示蓝色即为阳性，反之为阴性；2)将所述受试菌与报告菌株紫色杆菌(Chromobacterler violaceum)CV026在同一固体平板上共同划线培养，观察紫色杆菌(Chromobacterler violaceum)CV026菌体是否显示紫色，如果显示紫色即为阳性，反之为阴性；3)将所述受试菌划线接种于含500nM N-酰化高丝氨酸内酯的LB平板上培养24-48小时，再将报告菌株紫色杆菌(Chromobac terler violaceum)CV026在受试菌划线旁平行划线，观察紫色杆菌(Chromobacterler violaceum)CV026菌体是否显示紫色变浅或褪去，如果显示紫色变浅或褪去即为阳性，反之为阴性；4)将所述受试菌与报告菌株大肠杆菌(Escherichia coli)pSB403在固体平板上共同划线培养，观察大肠杆菌(Escherichia coli)pSB403菌体是否发光，如果发光即为阳性，反之为阴性；上述四项实验中，如果至少有一项实验显示阳性，则判断受试菌产生N-酰化高丝氨酸内酯(AHLs)群体感应信号分子，反之，则判断受试菌不产生N-酰化高丝氨酸内酯(AHLs)群体感应信号分子。所述N-酰化高丝氨酸内酯可为3-OH-C6-HSL、3-OH-C8-HSL、3-OH-C10-HSL、3-Oxo-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水产革兰氏阴性病原菌群体感应信号分子的快速检测试剂盒，包括根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ａ１３６、紫色杆菌（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｌｅｒｖｉｏｌａｃｅｕｍ）ＣＶ０２６、Ｎ－酰化高丝氨酸内酯、５－ 溴－４－氯－３－吲哚基－β－Ｄ－吡喃半乳糖苷或ＯＮＰＧ、和大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ｐＳＢ４０３。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周志刚，姚斌，何夙旭，刘玉春，石鹏君，罗会颖，杨培龙，孟昆，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]