蛋白质－蛋白质相互作用（ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ，ＰＰＩ）对于所有生物学过程都至关重要，因此，蛋白质相互作用研究一直是细胞生物学与分子生物学领域的一大研究热点。免疫共沉淀（ｃｏ－ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，ＣｏＩＰ）是以抗体和抗原之间的特异性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是发现和验证ＰＰＩ最常用、最有效的方法。传统的基于树脂的ＣｏＩＰ步骤复杂、费时费力，难以实现ＰＰＩ的通量化检测。本发明专利技术的核心是：利用重组蛋白的表位标签，在固定了抗标签抗体的玻璃醛基片上进行ＣｏＩＰ，再通过荧光标记的抗体进行相互作用的检测。该方法大大简化了传统ＣｏＩＰ的操作步骤，同时检测样品的通量化大大提高，是一个简便、快速、高通量研究ＰＰＩ的新型技术平台。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物领域，具体涉及一种对蛋白相互作用的检测方法。
技术介绍
免疫沉淀(immunoprecipitation， IP)是利用抗原和抗体的特异性结合(例 如细菌蛋白质"蛋白A〃和免疫球蛋白FC片段的特异性地结合)开发出来的方 法。例如，用蛋白X的抗体A免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白Y可能也 被沉淀下来。基于与蛋白X的生理性相互作用，蛋白Y的免疫沉淀就叫免疫共沉 淀(co-iramunoprecipitation， Co-IP)。免疫共沉淀是发现或验证两种蛋白质间生理性相互作用的最有效、最常用 的方法。它的具体操作是在保持蛋白一蛋白相互作用(protein-protein interaction, PPI)的条件下收获和裂解细胞，从细胞提取液中免疫沉淀目的蛋 白，然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离免疫沉淀物。目前多用纯化 的蛋白A预先结合固定在琼脂糖(argarose)磁珠(beads)上，使之与抗原、 抗体反应后的细胞裂解液作用，磁珠(beads)上的蛋白(prorein) A就能吸附 细胞裂解液中的抗原，从而达到沉淀靶标蛋白(抗原)和与其相互作用的蛋白的 目的。再进一步通过SDS-PAGE分离、免疫印迹(Western blot)检测相互作用蛋白。传统的co-IP作为检测和鉴定PPI最经典和有效的方法，在功能基因组研究中 发挥了巨大的作用，然而这种方法本身也存在着一些明显的不足如操作过程复 杂烦琐，费时费力，常需要培养大量细胞。并且，通过SDS-PAGE分离免疫沉淀物、 Western blot检测相互作用进一步延长了实验过程，极大程度上限制了检测的效 率，因而不符合高通量检测的要求。另一方面，在当今蛋白质组时代，相关研究的逐步深入，需要大量数据信息 作为分析研究蛋白质的的基础。传统的co-IP检测鉴定方法不能满足其需要。蛋白质芯片(protein array)是近年来兴起的一种有效的高通量研究方法。它与基 因芯片相似，是将蛋白质固定到固相载体上，然后与需检测的组织或细胞等进行 特异性地相互识别，再通过自动化仪器分析得出结果。与传统的研究方法相比， 蛋白质芯片的优点是小型化和高通量化，能够一次平行分析成千上万的蛋白样 品，具有很高的灵敏度和准确性。然而，现有蛋白芯片，如美国BD Clontech公 司推出的抗体芯片，是在芯片上排列了378种已知蛋白的单抗(Ab Microairay 380，目录号K1847-l)，通过免疫反应，在实验中筛选出与其中一种或几种单 抗相关联的蛋白。这种芯片，只通过免疫反应检测单抗与蛋白之间的反应，因而 需要点入多种单抗。其主要缺点是必须获得各种蛋白的抗体，而目前可获得的抗 体非常有限，难以满足当今蛋白质组学研究的要求。而本专利技术利用融合蛋白的表位标签，使用通用抗体制备抗体芯片，在芯片上进行任意两种蛋白相互作用的检 测，克服了抗体芯片制备中抗体难获得的瓶颈问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于将免疫共沉淀反应与蛋白芯片结合应用，利用芯片技术 建立一种简捷实用、快速灵敏的高通量分析蛋白一蛋白相互作用(PPI)的方法。本专利技术提供一种基于蛋白芯片的免疫共沉淀检测蛋白相互作用的方法，其 中，制备一Flag抗体芯片，然后将含有Flag-诱饵融合蛋白和Myc-猎物融合蛋 白的细胞裂解液加入到芯片表面进行免疫共沉淀反应，经荧光标记c-Myc抗体检 测诱馆蛋白和猎物蛋白是否具有相互作用。本专利技术提供的基于蛋白芯片的免疫共沉淀检测蛋白相互作用的方法，采用以 下步骤步骤一制备Flag抗体芯片，将醛基玻片分成多个芯片框，将anti-flag M2 单抗及作为抗体对照的鼠IgG喷点到各芯片框内，保存备用；步骤二构建诱饵和猎物表达载体，将诱馎的编码基因构建到flag标签载 体上，将猎物的编码基因构建到Myc标签载体上，分别形成诱饵融合蛋白和猎物 融合蛋白；步骤三细胞转染及制备裂解液，将诱饵和猎物真核表达载体共转染到细 胞中，收集细胞并充分裂解，将实验品细胞裂解液上清收集待用；同样制备阴性 对照品细胞裂解液收集待用；步骤四检测蛋白相互作用，将实验品细胞裂解液和对照品细胞裂解液分 别加入处理后的芯片中不同芯片框内，免疫共沉淀反应一定时间后，洗涤；在每 一芯片框内再加入anti-c-Myc-Cy3，反应一段时间后洗涤，干燥后用荧光芯片 扫描仪扫描；步骤五将荧光芯片扫描仪中获取的信号及数据输出，比较实验品和对照品的荧光信号，实验品信号强度强于对照品的，说明诱饵与猎物蛋白之间有相互 作用，反之，没有信号或信号微弱的说明诱饵与猎物蛋白之间没有相互作用。本专利技术提供的基于蛋白芯片的免疫共沉淀检测蛋白相互作用的方法，步骤一中Flag抗体芯片用贴膜分为3X6个芯片框，每个芯片框内平行点入anti-flag M2单抗及作为抗体对照的小鼠IgG， anti-flag M2单抗和小鼠IgG各点3个重 复点。本专利技术提供的基于蛋白芯片的免疫共沉淀检测蛋白相互作用的方法，步骤四中芯片处理是指用封闭液封闭芯片，室温孵育，然后用TBST重复洗涤；将实验品细胞裂解液和对照品细胞裂解液加入芯片框中的量为20u 1/框； 所述免疫共沉淀反应指在室温保湿条件下反应2小时； 所述洗涤指用TBST洗涤15分钟，重复3次；所述加入anti-Myc-Cy3单抗的浓度为1:200，加入量为20u 1/芯片框，反 应在室温避光保湿条件下反应1小时。本专利技术还提供一种蛋白相互作用检测试剂盒，包括一具有多个分区的醛基玻 片，上述方法中的FLAG和c-Myc标签载体和其对应的单抗，以及基于上述方法 的使用说明书。本专利技术提供的试剂盒中醛基玻片分为3X6个分区。本专利技术提供的试剂盒中，醛基玻片型号为CSS-100， FLAG标签载体为SIGMA 公司的pFLAG-CMV-2 ， c-Myc标签载体为(CLONTECH公司的pC匿-Myc ， FLAG单 抗为SIGMA公司的ANTI-FLAG M2单克隆抗体，c-Myc单抗为SIGMA公司的单克 隆ANTI-c-MYC Cy3 CONJUGATE CLONE 9E10。采用以上技术方案，本专利技术利用重组蛋白的表位标签，将抗标签的通用抗 体固定在醛基玻片上，使其捕获细胞裂解液中的靶标蛋白，在保持蛋白一蛋白相6互作用的条件下，通过荧光标记的抗体检测免疫共沉淀的蛋白，最后通过荧光芯 片扫描仪获得蛋白一蛋白相互作用的信号。其最大的特点是小型化和高通量化， 能够一次平行分析大量样品，具有很高的敏感度与准确性，并且操作简化，可特 异性高效检测细胞裂解液中蛋白与蛋白之间的相互作用。与现有的抗体芯片相 比，它不需要制备或购买各种蛋白的特异性抗体，而只需要两种通用的抗标签抗 体就能进行任意两种蛋白间相互作用的检测，克服了抗体芯片制备中抗体难获得 的瓶颈问题。另一方面，与其他用于蛋白相互作用检测的蛋白芯片相比，它不需 要进行各种蛋白的表达纯化，而直接利用诱饵和猎物共转染的细胞裂解液进行相 互作用检测，克服了蛋白芯片制备中蛋白来源难的瓶颈问题，既省时省力，又大 大节约研究成本。附图说明图l为本专利技术方法实验流程示意图。图2为本专利技术芯片免疫共沉淀及相互作用检测示意图。图3为本专利技术中pCMV-myc-p65本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于蛋白芯片的免疫共沉淀检测蛋白相互作用的方法，其特征在于，制备一Ｆｌａｇ抗体芯片，然后将含有Ｆｌａｇ－诱饵融合蛋白和Ｍｙｃ－猎物融合蛋白的细胞裂解液加入到芯片表面进行免疫共沉淀反应，经荧光标记ｃ－Ｍｙｃ抗体检测诱饵蛋白和猎物蛋白是否具有相互作用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘琼明，林从，何为，许丹科，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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