戊型肝炎病毒荧光定量PCR检测方法技术

本发明专利技术是一种涉及生物工程领域的检测方法，特别是用于定量检测临床标本中戊型肝炎病毒（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　　Ｅ　　ｖｉｒｕｓ，ＨＥＶ）滴度的荧光定量ＰＣＲ检测方法。本发明专利技术包括如下步骤：病毒特异性定量ＰＣＲ引物和探针设计；标准分子的构建；病毒样本ＲＮＡ的提取；样本ＲＮＡ的ｃＤＮＡ合成；荧光定量ＰＣＲ检测方法的建立和优化。本发明专利技术的检测灵敏度可达１０°数量级的病毒拷贝，具有良好的稳定性和特异性，可用于大批量的样本检测，并可对样本的病毒载量进行准确定量。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种戊型肝炎病毒滴度的荧光定量ＰＣＲ检测方法，其特征在于检测方法步骤如下：（１）．病毒特异性定量ＰＣＲ引物和探针设计，包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，在Ｇｅｎｂａｎｋ中检索戊型肝炎病毒全序列，通过生物信息学比对分析，选取序列保守片段，应用ｐｒｉｍｅｒｅｘｐｒｅｓｓ软件和ｐｒｉｍｅｒｐｒｅｍｉｅｒ５．０软件，设计一对ＰＣＲ引物和Ｔａｑｍａｎ探针，探针５’端的荧光报告基团是ＦＡＭ，３’端标记的荧光淬灭基团为ＴＡＭＲＡ，引物和探针位于戊型肝炎病毒ＯＲＦ２区域，目的扩增片段为１５１ｂｐ，扩增序列为：ＧＡＡＴＧＣＴＣＡＧＣＡＧＧＡＴＡＡＧＧＧＴＡＴＴＧＣＡＡＴＣＣＣＧＣＡＴＧＡＣＡＴＣＧＡＣＣＴＣＧＧＧＧＡＧＴＣＴＣＧＴＧＴＡＧＴＴＡＴＴＣＡＧＧＡＴＴＡＴＧＡＣＡＡＣＣＡＡＣＡＴＧＡＧＣＡＧＧＡＣＣＧＡＣＣＧＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＡＴＣＧＣＧＣＣＣＴＴＴＴ　ＴＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧＡＧＣＴ引物和探针序列为：上游引物：ＨＥＶ－１（＋）：ＧＡＡＴＧＣＴＣＡＧＣＡＧＧＡＴＡＡＧＧＧＴ；下游引物：ＨＥＶ－２（－）：ＡＧＣＴＣＧＧＡＧＧＡＣＡＧＡＡＡＡＡＧＧ；Ｔａｑｍａｎ探针序列：５’－ＦＡＭ－ＣＣＧＣＡＴＧＡＣＡＴＣＧＡＣＣＴＣＧＧＧ－ＴＡＭＲＡ－３’；（２）．定量标准品的构建根据确定的ＰＣＲ引物，利用ＤＮＡ重组技术将包含目的扩增片段的基因克隆到质粒载体ｐＥＴ－２８ａ中，构建的重组质粒ｐＥＴ２８ａ－ＯＲＦ２作为检测戊型肝炎病毒滴度的定量标准品；（３）．样本中戊型肝炎病毒的分离及其ＲＮＡ的提取，并针对病毒含量较低的样本用聚乙二醇和氯化钠进行浓缩，提高检测的灵敏度；（４）．对提取的样本ＲＮＡ进行逆转录反应，获得样本ｃＤＮＡ；（５）．定量检测方法的优化和建立通过筛选不同的Ｍｇ↑［２＋］浓度、引物浓度、Ｔａｑｍａｎ探针浓度，选择具有高灵敏度、合适反应效率的反应体系和反应条件。并通过对反应体系的灵敏度、稳定性和特异性等指标对建立的荧光定量ＰＣＲ方法进行综合评价；（６）．经过对临床标本的检测进行应用评估，验证建立的荧光定量ＰＣＲ的可靠性。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈勇，沃恩康，洪艳，王怡婷，
申请(专利权)人：浙江省医学科学院，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]