中国南海信号芋螺神经毒素基因Lt3.1及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种新的中国南海信号芋螺Ｍ－超家族毒素基因Ｌｔ３．１及其编码的多肽序列ｌｔ３ａ，以及该多肽在制备神经生物学研究的工具药和镇痛药物中的应用。本发明专利技术通过构建ｃＤＮＡ文库的方法，从中国南海信号芋螺毒管中克隆得到的新的Ｍ－超家族芋螺毒素，Ｌｔ３．１的ｃＤＮＡ序列如序列表中〈４００〉１序列所示。该基因编码的多肽（芋螺毒素ｌｔ３ａ），前体肽氨基酸序列如序列表〈４００〉２序列所示，推测的成熟肽氨基酸序列如序列表〈４００〉３序列所示。本发明专利技术的神经毒素ｌｔ３ａ能增加钠通道开放电流且具有镇痛作用，可用于制备神经生物学研究的工具药和镇痛剂。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种中国南海信号芋螺M-超家族毒素基因Lt3. 1及其编码的多 肽序列lt3a和该多肽的制备技术，以及该毒素在神经生物学研究，离子通道药 物和镇痛药物开发中的应用。
技术介绍
芋螺属于软体动物门腹足纲芋螺科(Conidae)，多数栖息在热带海洋的浅海 水域，少数在水深几米至200余米的深水区，因外形呈圆锥形或芋头状而得名。 芋螺是比较年轻的生物，化石记录证明芋螺属最早出现于始新世(Eocene)，中 生代(tnesozoic)时期与陆地上恐龙同时灭绝的海洋捕食性软体动物菊石的消失 客观上促进了芋螺的第一次大规模的物种形成。芋螺的第二次大规模的辐射始于 中新世(Miocene)，基本上持续到现在。每个芋螺物种的形成都伴随全新的毒液 成分和有效的毒液输送装置的进化。芋螺具有强大的自然进化能力，全球有超过500种芋螺，单一种属中就包括 数百种物种，这使芋螺成为海洋无脊椎动物中进化最成功的生物。芋螺是食肉动 物，靠毒液来捕食，根据其捕食习性可分为食鱼芋螺(piscivorous)、食螺芋螺 (molluscivorous)、食虫芋螺(vermivorous)。食虫性芋螺种类最多，占全部芋 螺种类的70%左右。食鱼性芋螺占芋螺总数最少，但毒性最强，报道的芋螺致死 事件基本上是该类芋螺造成的，如织锦芋螺(C. t^"Je)、地纹芋螺 (61. ge。gr邵/ 〃s) 等。芋螺毒液是捕食与防御作用的主要武器，它是由许多单一毒肽组成的鸡尾酒 样的混合毒素，称为芋螺毒素(Conotoxin)。芋螺毒素能特异地作用于神经系统 的电压门控和配体门控离子通道的不用亚型和递质受体，因此被广泛用于神经生 物学研究。芋螺毒素通常为由7 41个氨基酸残基组成的小分子多肽。大多富含 半胱氨酸，具有高度保守的二硫键骨架。与蜘蛛、蝎、蛇、海葵等许多动物的毒素比较(40 80个氨基酸左右)，芋螺毒素的肽链短得多，富含二硫键，分子结 构更为紧密，生物活性更高。大多数芋螺毒素均由单一的mRNA编码，原始的翻译 产物是一种特定的多肽前体，约为70-120个氨基酸残基，经蛋白酶水解后得到 成熟肽。二十世纪八十年代初，美国犹它大学01iveraBM学者实验室最早开展了芋螺 毒素全面系统研究工作。芋螺毒素以其分子小，结构稳定，对受体作用范围广并 且活性强的特点，已经跃居于动物神经毒素研究的首位。由于它们作用靶点广泛， 能高度特异地结合细胞膜上祌经递质和激肽的受体和各种离子通道， 一方面，可 以被直接开发成药物或作为新药的先导化合物应用于临床；另一方面，可以成为 神经生物学中发现鉴定新受体，研究受体构效关系及其调控细胞分子机理的重要 探针，并推动了离子通道的进化研究。保守估计有50000种以上不同的芋螺毒素存在，至今已经得到分离的芋螺毒 素有近千种，数十种芋螺毒素已申请美国专利。它们在镇痛、局部缺血性保护、 癫痫治疗、某些疾病诊断和受体研究中具有广泛的应用价值，有的已进入临床研 究或己被FDA正式批准为治疗新药，用作特异诊断试剂和镇痛药。目前，由Elan 公司进行开发的CTX M V1IA (SNXIII，商品名Ziconotide)，因其直接作用 分布于神经组织的N-型钙离子通道，无需第二信使或蛋白，不成瘾，已成为治疗难治性神经疼痛的新一代药物，已通过了in期临床试验，正式被FDA批准上市。而另一个衍生于w-CTX C VID的化合物AM336作用类似于Ziconotide，因其对 N-钙通道的选择性更强，副作用更低，已经批准作为对抗严重抗吗啡作用慢性疼 痛的治疗药物进入临床试验阶段。此外，Conantokin-G作为NMDA受体高度选择 性的拮抗剂，对难以治疗的癫痫有效，也己完成I期临床试验。芋螺毒素药用研 究的其他方向还有具有去甲肾上腺素转运蛋白抑制作用的T-超家族芋螺毒素， 可用于治疗抑郁症。以及抑制d1-肾上腺素受体的一些芋螺毒素，可用于治疗 良性前列腺过度增生引起的尿失禁。与此同时，围绕着增强药物分子的稳定性， 降低过敏反应以及增加溶解性以利于口服目的的分子改造研究工作也正在进行。 另一方面，芋螺毒素作为研究离子通道和膜受体的极好探针或工具，已经成 为电压门控型钙离子通道(VSCCs)和N型乙酰胆碱受体(nAChRs)等通道、受体 鉴定和诊断的标准工具，在神经药理学领域得到了广泛的应用。芋螺在我国南海海域有广泛分布，已查明的芋螺约有80余种，主要分布在 台湾、广东、广西、海南诸省以及西沙和南沙群岛等。近年来国内也开展了芋螺 毒素的生物化学、分子生物学以及药理作用等方面的研究工作。中国科学院北京 药物化学研究所的陈冀胜研究员等人己自桶形芋螺(C.A"""'/7"S)、独特芋螺 (C. cara"eri"/7e^s)、菖蒲芋螺(C. ye;a7J咖)、地纹芋螺等类芋螺中分离 鉴定了十余种新序列的芋螺毒素。军事医学科学院生物工程研究所的卢柏松、黄 培堂以及戴秋云等从我国的线纹芋螺、织锦芋螺中也发现了一些新的毒素成分和 基因序列。热带农业大学彭世清、罗素兰等己从菖蒲芋螺基因组中克隆到两个新 芋螺毒素基因(GenBank登记号AY316159， AY316160);同时还从海南产的大理 石芋螺股mw re"5)、幻芋螺(C历a^A9)、信号芋螺(C7i"e/^iA )、勇 士芋螺(C.肌7es)、独特芋螺、织锦芋螺、桶形芋螺、疵篙芋螺(Ch'7A/"s) 等共12个种中分别发现了多种具有药用功能的芋螺毒素及其基因。虽然我国有 着丰富的芋螺资源，但由于起步较晚，目前对于芋螺毒素的研究尚处于初期阶段， 有着广阔的研究空间和开发前景。由于芋螺毒素在其基因序列和蛋白质结构及功能方面差异较大，具有种类繁 多，结构复杂和高度遗传多样性特征。构建信号芋螺毒管cDNA文库可以系统地 研究食虫芋螺的毒素组成、表达谱，发现新的食虫芋螺特有的毒素序列。迄今为 止，国外已构建了多种芋螺的cDNA文库，中国南海信号芋螺是一种食虫性芋螺， 世界上尚没有关于它的毒素研究的报道。因此，开展我国南海信号芋螺毒素的生物化学、药理学尤其是其分子生物学 和基因工程
的探索研究将有助于对新毒素分子相应受体及其作用机制 的深入研究，而且可为我国芋螺海洋资源的药用开发利用提供重要理论依据。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新的中国南海信号芋螺M-超家族毒素基因 Lt3. 1及其编码的多肽序列lt3a及其片段、类似物和衍生物。 本专利技术的另一目的是提供该多肽的分离纯化方法。 本专利技术的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。 本专利技术的另一个目的是提供这些多肽的用途。本专利技术的第一方面，提供一种新的神经毒素多肽，其包括含有序列表〈400〉2所示的氨基酸序列的多肽、或者其保守性变异多肽、或其活性衍生物。 上述的新的祌经毒素多肽优选自以下组之一(a) 由序列表〈400〉2所示的氨基酸序列组成的多肽；(b) 将(a)中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或舔加 而形成的具有相同功能的由(a)衍生的多肽。本专利技术的第二方面，提供一种多核苷酸，该多核苷酸包含有选自以下组之一核苷酸序列(a) 编码上述多肽的多核苷酸；(b) 与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳的，该多核苷酸编码本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种神经毒素多肽，其包括含有序列表〈４００〉２所示的氨基酸序列的多肽、或者其保守性变异多肽、或其活性衍生物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐安龙，曾夏芸，王磊，皮灿辉，任政华，刘君梁，孙丹丹，周茂军，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81[]