一种DNA稳定性同位素探针原位揭示河湖底泥中厌氧铁氨氧化细菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种DNA稳定性同位素探针原位揭示河湖底泥中厌氧铁氨氧化细菌的方法，包括：(1)采集氮素污染河湖底泥样品；(2)进行

【技术实现步骤摘要】
一种DNA稳定性同位素探针原位揭示河湖底泥中厌氧铁氨氧化细菌的方法
本专利技术涉及微生物生态学
，更具体地，涉及一种DNA稳定性同位素探针原位揭示河湖底泥中厌氧铁氨氧化细菌的方法。
技术介绍
河流(湖泊)氮素污染是一个广泛、持久的环境污染问题，其主要成因是河流接受沿岸大量的氮素输入负荷超出了自身的自净能力，长期受到来自流域农村生活、农业施肥、畜禽养殖及城市生活等面源污染。为提高生态系统的修复能力和寻求新的生物脱氮方法，人们一直对自然界氮循环路径进行着不断的探索与认识。厌氧铁氨氧化(又称Feammox)是水、陆生态系统中新发现的氮素转化途径，连同异养反硝化、共反硝化及厌氧氨氧化路径共同促进污染水域的氮素转化。Feammox已经在森林土壤、沼泽、湿地等有见报道，将氨氮(NH4+-N)分别氧化为氮气(N2)、亚硝酸盐氮(NO2--N)和硝酸盐氮(NO3--N)作为最终产物。过程产生的NO2--N和NO3--N再联合Fe(II)氧化和异养反硝化等过程可实现深度的总氮(TN)去除效果。由于Fe元素在地球生物圈广泛存在，储存量高，其变价态形式多样(包括零价铁、Fe(II)和Fe(III)等)且易转化，因此Feammox具有广泛的研究与应用价值。厌氧铁氨氧化具有在厌氧条件下利用Fe(III)氧化NH4+产生的N2的特性，相比于传统硝化反硝化具有节省100％曝气和100％有机碳源的优势，具有巨大的环境与经济效益。然而，受研究水平和时间的限制，与Feammox相关的微生物群落生物信息非常缺少，物种鉴定和生理特征分析受到很大挑战。有研究者观察到Geobacter和Shewanella属的细菌丰度与Fe(III)的还原速率和15NH4+-N降解速率呈正相关，从而推断其是Feammox的执行者。另有同位素示踪实验表明Geothrix与Shewanella属与Feammox驱动的30N2产生有关。这些研究仅从统计和观察角度间接推断该途径的功能微生物群落，无直接证据显示Feammox细菌的群落生态功能和生理代谢特点。由于具有厌氧铁氨氧化功能的细菌在自然界种类较多，并且与其他细菌生态关联性较高，实验室不可以单独培养，因其环境非培养的特点而难以依靠传统单纯培养技术鉴定。因此，基于群落代谢功能的微生物鉴定方法显得尤为重要。基于DNA的稳定性同位素探针技术(DNA-basedStableIsotopeProbing，DNA-SIP)是联系微生物群落功能和分子系统发育鉴定的优选方法之一。通过在微生物代谢底物中标记重同位素(例如13C或15N)的方法，可对代谢活跃且特异性降解底物的微生物基因组进行标记，然后通过氯化铯(CsCl)密度梯度离心，分离出重层功能细菌DNA，与现代第二代高通量测序技术结合，达到活性群落下游结构分析的目的。该方法数据结果可靠、重复性高、操作系统性强，适合复杂环境样品的群落结构鉴定。专利CN103966318B公开有利用DNA稳定性同位素探针原位揭示判别稻田甲酸利用型产甲烷古菌的方法，能够敏锐的、原位的揭示稻田甲酸利用型产甲烷古菌，但是其所针对的是稻田甲酸利用型产甲烷古菌，并不适用于厌氧铁氨氧化细菌的群落生态功能和生理代谢特点。虽然厌氧铁氨氧化为自养型生物脱氮技术，相比消耗碳源的传统异养反硝化具有不可比拟的经济优势。然而，在复杂微生物体系环境中，由于厌氧铁氨氧化细菌丰度限制和异养反硝化、厌氧氨氧化等其他脱氮路径存在的干扰，针对厌氧铁氨氧化细菌的鉴定和表征是一个微生物分析技术上的难点。同时，在天然有机碳源较高和溶解氧高的底泥中，异养反硝化脱氮菌群丰度通常较高，而利用Fe(III)作为电子受体的自养型厌氧铁氨氧化细菌丰度通常较小。因此，利用传统高通量测序反映出的菌群比例也较小，分析困难。因此，亟需发开一种针对厌氧铁氨氧化细菌的可靠、准确的鉴定方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种DNA稳定性同位素探针原位揭示河湖底泥中厌氧铁氨氧化细菌的方法。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：一种DNA稳定性同位素探针原位揭示河湖底泥中厌氧铁氨氧化细菌的方法，包括如下步骤：S1.原位采集水体底泥样本；S2.13C-、15N-双标记特异性孵育厌氧铁氨氧化细菌：将底泥样本置于容器中，添加Fe(III)，再添加13C-NaHCO3和15N-NH4Cl，并同时添加C2H2气体，密封容器；孵育5～6天后，提取土壤DNA；S3.将步骤S2的土壤DNA通过氯化铯超高速离心分离重层DNA；S4.对步骤S3浮力密度梯度分层DNA进行标记程度鉴定，对13C，15N-双标记且筛选出的重浮力密度DNA进行高通量测序分析。本专利技术利用微生物合成代谢的差异，通过13C-和15N-双重同位素孵育标记活性铁氨氧化细菌的方法，同时利用乙炔抑制干扰细菌异养反硝化细菌和厌氧氨氧化细菌，通过超高速离心方法分离重层标记的13C-和15N-DNA，利用第二代高通量测序技术分析重层DNA基因库中的微生物群落结构，使非培养厌氧铁氨氧化细菌鉴定成为可能，提高了稀有丰度厌氧铁氨氧化细菌的鉴定率，为鉴定厌氧铁厌氧化细菌提供了一套可靠、准确的鉴定方法。优选地，步骤S1所述水体为河流或湖泊。优选地，步骤S2所述底泥样本为预培养后的污泥，具体为将混合均匀的新鲜污泥置于容器中并加水稀释，置换容器中的气体，以制造无氧反应环境，24～26℃避光孵化4～5天；目的在于以耗尽样品中原有的电子接受体。优选地，所述Fe(III)的添加浓度为20～25mg-Fe/L。优选地，所述13C-NaHCO3和15N-NH4Cl的用量分别为30～35mg-C/L和15～20mg-N/L。优选地，所述C2H2气体的用量为其所填充的容器体积的30％。优选地，步骤S2还包括同时以添加12C-NaHCO3和14N-NH4Cl，添加13C-NaHCO3和15N-NH4Cl的处理分别作为对照。具体地，步骤S2为将实验污泥样品等量分成三份，将污泥样本分别置于不同容器中，添加Fe(III)，在1#对照组分别添加12C-NaHCO3和14N-NH4Cl，2#对照组分别添加13C-NaHCO3和15N-NH4Cl，3#实验组分别添加13C-NaHCO3和15N-NH4Cl，并同时添加30％顶空气体积C2H2以抑制异养反硝化和厌氧氨氧化细菌实验组，分别用丁基橡胶塞和铝盖密封血清瓶，在避光恒温摇床分别孵育5～6天；针对孵育后的污泥样品，分别采用土壤DNA提取试剂盒提取基因组总DNA样品。优选地，步骤S3具体为将DNA样品与GB缓冲液混合得DNA-GB样品溶液，再分别添加CsCl溶液、GB溶液，调整样品目标折射率为1.4029±0.0002；再18～22℃，180000～200000×g，超高速离心44～46h；离心结束后，用固定流速泵对离心管中的混合液进行分层，用PEG6000和70％乙醇洗涤每层DNA。优选地，所述DNA-GB样品溶液、CsCl溶液、GB溶液的体积比为0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNA稳定性同位素探针原位揭示河湖底泥中厌氧铁氨氧化细菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1.原位采集水体底泥样本；/nS2.

【技术特征摘要】
1.一种DNA稳定性同位素探针原位揭示河湖底泥中厌氧铁氨氧化细菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.原位采集水体底泥样本；
S2.13C-、15N-双标记特异性孵育厌氧铁氨氧化细菌：将底泥样本置于容器中，添加Fe(III)，再添加13C-NaHCO3和15N-NH4Cl，并同时添加C2H2气体，密封容器；孵育5～6天后，提取土壤DNA；
S3.将步骤S2的土壤DNA通过氯化铯超高速离心分离重层DNA；
S4.对步骤S3浮力密度梯度分层DNA进行标记程度鉴定，对13C，15N-双标记且筛选出的重浮力密度DNA进行高通量测序分析。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1所述水体为河流或湖泊。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2所述底泥样本为预培养后的污泥，具体为将混合均匀的新鲜污泥置于容器中并加水稀释，置换容器中的气体，以制造无氧反应环境，24～26℃避光孵化4～5天。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Fe(III)的添加浓度为20～25mg-Fe/L。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述13C-NaHCO3和15N-NH4Cl的添加浓度分别为30～35mg-C/L和15～20mg-N/L。


6.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：李宁，江进，许燕滨，潘汉平，王桢，胡颖斌，曹节，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44