一种低成本、高通量间接量化蛋白表达水平的方法及其应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，尤其涉及一种低成本、高通量间接量化蛋白表达水平的方法及其应用。本申请基于Ribosome profiling技术通过超高速离心与梯度密度有效分离核糖体‑RNA复合物；之后从复合物中提取RNA，反转录，获得300‑600bp的文库，测序。本发明专利技术结合3’端测序技术，有针对性的对每条RNA的3’端进行测序，从而降低测序的数据量，达到降低成本的目的；同时，本技术通过对与核糖体结合的RNA进行高通量测序，使得检测基因数接近20000，提高了通量。

【技术实现步骤摘要】
一种低成本、高通量间接量化蛋白表达水平的方法及其应用
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种低成本、高通量间接量化蛋白表达水平的方法及其应用。
技术介绍
蛋白质是构成细胞的基本有机物质，承担着机体的各项生命活动。对蛋白质表达丰度的评估或测定，有助于进一步阐明机体各项生理活动的机制，进而解析一些表型变化或疾病发生的原因。根据中心法则，蛋白质的产生需要经过DNA的转录及RNA的翻译。转录水平，RNA-seq是目前应用最为广泛的一种间接评估蛋白表达水平的技术，成本低且通量较高，但是由于从转录到蛋白经过多个生理过程，导致两者之间相关性较低。蛋白质谱作为最直接检测蛋白丰度的一种手段，能够精确定量蛋白质表达丰度。但是由于本身技术的限制，检测通量较低，不能涵盖更多的基因，且单个样本成本较高。2009年Ingolia等人基于翻译水平开发了Ribo-seq技术，经过对核糖体包被的RNA片段进行测序，能够有效测定哪些RNA进行了翻译，翻译的丰度是多少，从而更近一步评估蛋白丰度。该技术不仅相对于RNA-seq提升了蛋白评估的精确性，而且相较于蛋白质谱通量较高。但是该技术较为复杂且成本较高，目前市场价在4000-8000元/样本，不宜用于大批量样本的测定。Polysomeprofiling技术通过超高速离心与梯度密度有效分离核糖体-RNA复合物，RNA提取后针对性的对翻译的RNA进行测序，从而达到评估蛋白丰度的目的。但是由于单个样本的成本也较高，目前尚未得到广泛应用。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种低成本、高通量间接量化蛋白表达水平的方法及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。本专利技术是这样实现的，一种低成本、高通量间接量化蛋白表达水平的方法，包括以下步骤：利用Ribosomeprofiling技术，通过超高速梯度密度离心，分离核糖体-RNA复合物；分离纯化RNA；构建测序文库、结合3’端测序技术对纯化后的每条RNA的3’端进行测序。进一步地，所述构建测序文库、结合3’端测序技术对纯化后的每条RNA的3’端进行测序步骤包括利用带OligodT的磁珠提纯mRNA，然后基于SMART反转录原理进行RNA反转录；之后，获取cDNA双链；Tn5酶切，富集RNA3’端；以回收的3’端产物为模板，扩增纯化获得300-600bp的文库；测序，间接量化蛋白表达水平。进一步地，所述基于SMART反转录原理进行RNA反转录步骤中涉及的引物序列包括：Ad1cgacgtaccagattacgctcc/rG//rG//rG/；Ad2-1ccgcacgctaactagtgtcgCTGATCGTNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；Ad2-2ccgcacgctaactagtgtcgACTCTCGANNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；Ad2-3ccgcacgctaactagtgtcgTGAGCTAGNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；Ad2-4ccgcacgctaactagtgtcgGAGACGATNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；Ad2-5ccgcacgctaactagtgtcgCTTGTCGANNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；Ad2-6ccgcacgctaactagtgtcgTTCCAAGGNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；Ad2-7ccgcacgctaactagtgtcgCGCATGATNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；Ad2-8ccgcacgctaactagtgtcgACGGAACANNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；Ad2-9ccgcacgctaactagtgtcgCGGCTAATNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；Ad2-10ccgcacgctaactagtgtcgATCGATCGNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；Ad2-11ccgcacgctaactagtgtcgGCAAGATCNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；Ad2-12ccgcacgctaactagtgtcgGCTATCCTNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN。进一步地，所述基于SMART反转录原理进行RNA反转录步骤中涉及的反应体系包括：2.75ulRNA，0.5ulAd2引物(50uM)，0.5uldNTP(10mM)；置于65℃变性5分钟，然后放回冰上超过1分钟；之后，向其中加入RNaseinhibitor(40U/ul)0.25ul，SuperScriptIVfirst-strandbuffer(5X)2ul，DTT(100mM)0.5ul，Betaine(5M)2ul，氯化镁(1M)0.06ul，Ad1引物(50uM)1ul，SuperScriptIVreversetranscriptase(200U/ul)0.5ul；所述Ad2引物为所述的Ad2-1至Ad2-12引物中的一条。进一步地，所述基于SMART反转录原理进行RNA反转录步骤中至少涉及12个样品或12的倍数的样品；RNA反转录完成后，将反转后的体系，每12份混合一份，获取cDNA双链。进一步地，获取cDNA双链的步骤包括：以15ul混合后的混合液为反应模板，KAPAmix(DNA聚合酶)25ul，Ad1k与Ad2-bio为前、后引物各1ul，补水至50ul；反应条件是：95℃变性3min，98℃20s，67℃15s，72℃6min，以上三个温度阶段共循环18次，然后72℃延伸5min；所述Ad1k与Ad2-bio序列为：Ad2-bioccgcacgctaactagtgtcg；Ad1kcgacgtaccagattacgctcc。进一步地，所述以回收的3’端产物为模板，扩增纯化获得300-600bp的文库步骤中涉及的引物包括gAd3-P5-1:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTCTCTATTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGT；Long-Ad2-P7-1:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGCCGCACGCTAACTAGTGTCG。如上述的一种低成本、高通量间接量化蛋白表达水平的方法在对蛋白质表达丰度的评估和/或测定中的应用。综上所述，本专利技术的优点及积极效果为：1、精确性。本技术基于Ribosomeprofiling技术，通过超高速梯度密度离心，将核糖体-RNA复合物分离出来。与核糖体结合的RNA即本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种低成本、高通量间接量化蛋白表达水平的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n利用Ribosome profiling技术，通过超高速梯度密度离心，分离核糖体-RNA复合物；分离纯化RNA；构建测序文库、结合3’端测序技术对纯化后的每条RNA的3’端进行测序。/n

【技术特征摘要】
1.一种低成本、高通量间接量化蛋白表达水平的方法，其特征在于，包括以下步骤：
利用Ribosomeprofiling技术，通过超高速梯度密度离心，分离核糖体-RNA复合物；分离纯化RNA；构建测序文库、结合3’端测序技术对纯化后的每条RNA的3’端进行测序。


2.根据权利要求1所述的一种低成本、高通量间接量化蛋白表达水平的方法，其特征在于：所述构建测序文库、结合3’端测序技术对纯化后的每条RNA的3’端进行测序步骤包括利用带OligodT的磁珠提纯mRNA，然后基于SMART反转录原理进行RNA反转录；之后，获取cDNA双链；Tn5酶切，富集RNA3’端；以回收的3’端产物为模板，扩增纯化获得300-600bp的文库；测序，间接量化蛋白表达水平。


3.根据权利要求2所述的一种低成本、高通量间接量化蛋白表达水平的方法，其特征在于：所述基于SMART反转录原理进行RNA反转录步骤中涉及的引物序列包括：
Ad1cgacgtaccagattacgctcc/rG//rG//rG/；
Ad2-1ccgcacgctaactagtgtcgCTGATCGTNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；
Ad2-2ccgcacgctaactagtgtcgACTCTCGANNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；
Ad2-3ccgcacgctaactagtgtcgTGAGCTAGNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；
Ad2-4ccgcacgctaactagtgtcgGAGACGATNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；
Ad2-5ccgcacgctaactagtgtcgCTTGTCGANNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；
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Ad2-7ccgcacgctaactagtgtcgCGCATGATNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；
Ad2-8ccgcacgctaactagtgtcgACGGAACANNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；
Ad2-9ccgcacgctaactagtgtcgCGGCTAATNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；
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Ad2-11ccgcacgctaactagtgtcgGCAAGATCNNNNNNNNTTTTTTTTTTTT...

【专利技术属性】
技术研发人员：李林，朱万超，梁焰，陈思佳，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42