一种高通量高灵敏度单碱基分辨率检测RNA m6A的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种高通量高灵敏度单碱基分辨率检测RNA m6A的方法及其应用。该方法包括如下步骤：(1)提取样品中的总RNA并去除rRNA，得到RNA样品；(2)将RNA样品进行片段化处理并分成2份，为RNA片段I和II；(3)将RNA片段I进行免疫共沉淀及交联处理；(4)将交联处理得到的复合体和RNA片段II分别进行3′末端接头连接；(5)分别将其反转录成cDNA并连接3′末端接头，PCR扩增，分别构建得到hmCLIP文库和input文库；(6)将hmCLIP文库和input文库利用高通量测序平台进行测序。本发明专利技术方法耗时短、灵敏度高，适用于少量标本和RNA完整性低的标本中RNA m6A的检测。

【技术实现步骤摘要】
一种高通量高灵敏度单碱基分辨率检测RNAm6A的方法及其应用
本专利技术属于生物
，特别涉及一种高通量高灵敏度单碱基分辨率检测RNAm6A的方法及其应用。
技术介绍
RNA的m6A修饰发生在RNA的腺苷酸的N6位，是真核生物mRNA上最常见的一类表观转录后修饰，约占mRNA上腺嘌呤的0.1～0.4％。RNA的m6A修饰过程是由甲基转移酶复合体催化产生并由去甲基转移酶催化去甲基化，因此是一个动态可逆的过程。越来越多的研究表明m6A在胚胎发育、神经发生、肿瘤进展、性别决定等重要的生命过程扮演着重要的角色。因此精确定位RNA的m6A修饰位点对于研究m6A调控生命活动的具体作用机制极为重要。然而m6A与A的物理化学性质相似，并不影响碱基的配对能力，且尚未有一种化学试剂能改变这一修饰。随着抗体依赖的二代测序技术meRIP和miCLIP的发展，m6A重要的生物功能逐渐被揭示。meRIP首先将RNA片段化，随后分为两份：一份用抗m6A的抗体进行富集，随后将富集得到的RNA片段进行文库构建作为meRIP组，另一份用来普通的RNA文库构建作为input组，通过生物信息学手段进行分析确定m6A修饰的区域；miCLIP的原理与meRIP相似但有不同，首先用m6A抗体富集片段化的RNA，将富集得到的m6A抗体-RNA复合体进行紫外254nm交联，根据交联产物被蛋白酶K消化后在交联位点会残留一个氨基酸残基，在逆转录过程中会发生C→T突变的特性，利用生物信息学手段可以单碱基分辨m6A修饰位点。尽管meRIP和miCLIP都能实现全转录组水平的m6A信息检测，然而目前还存在一些缺点：一、这两种方法对样本RNA的需求量都很大，一般RNA用量在500ug左右，在稀有的标本中难以实现m6A的检测；二、meRIP是通过将RNA片段化后依据m6A抗体富集的方法实现的，最终得到的是一个被抗体富集的带有m6A位点的片段，分辨率较低；三、miCLIP仅是通过抗体富集得到的峰确定突变位点，对于本底表达水平较高的RNA会存在较高的假阳性率；四、miCLIP的流程繁琐，步骤较多，对实验条件要求较高。为了更好的研究m6A的功能及其作用机制，建立一种高效、灵敏、单碱基分辨率的m6A检测方法意义重大。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种高通量高灵敏度单碱基分辨率检测RNAm6A的方法。本专利技术的另一目的在于提供所述高通量高灵敏度单碱基分辨率检测RNAm6A的方法的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种高通量高灵敏度单碱基分辨率检测RNAm6A的方法，包括如下步骤：(1)制备去rRNA的RNA样品提取样品中的总RNA，然后去除总RNA中的rRNA，得到RNA样品；(2)RNA片段化将步骤(1)中得到的RNA样品进行片段化处理，得到RNA片段，并将RNA片段分成2份，命名为RNA片段I和RNA片段II；(3)免疫共沉淀及交联将步骤(2)中得到的RNA片段I进行热变性处理，然后与特异识别m6A位点的抗体进行反应，得到反应液；再将反应液在紫外条件下进行交联(识别位点与抗体之间形成共价交联位点)，得到交联复合体；将proteinA/Gbeads加入到交联复合体进行免疫共沉淀，得到免疫共沉淀产物；其中，交联的条件为：150～1500mj/cm2，254nm的UV交联2～4次；(4)RNA接头连接①将步骤(3)中得到的免疫共沉淀产物进行RNA3′末端荧光标记接头连接，连接后洗去多余的接头，变性洗脱，电泳分离，得到交联的连接产物；然后在交联的连接产物中加入蛋白酶K进行消化，消化后用silane磁珠、以及NaCl或PEG8000中的至少一种对RNA进行回收，得到纯化后的RNA；②将步骤(2)中得到的RNA片段II进行RNA3′末端接头连接并进行回收，得到接头连接后的RNA；(5)建库将步骤(4)①中得到的纯化后的RNA逆转录成cDNA，然后将cDNA进行3′末端接头连接，得到接头连接后的cDNA；再将接头连接后的cDNA进行PCR扩增，纯化(片段大小筛选)，得到PCR产物，即构建得到hmCLIP文库(m6A-CLIP文库)；再将步骤(4)②中得到的接头连接后的RNA替代步骤(4)①中得到的纯化后的RNA，按相同的操作步骤，构建得到input文库；(6)测序将步骤(5)中构建得到的hmCLIP文库和input文库利用高通量测序平台进行测序。步骤(1)中所述的样品为细胞、组织或病理切片石蜡标本；优选为石蜡标本；更优选为甲状腺癌细针穿刺石蜡标本。步骤(1)中所述的总RNA的提取可采用本领域的常规方法或RNA提取试剂盒进行提取；优选为采用QIAGENRNeasyFFPEkit试剂盒进行提取。步骤(1)中所述的去除总RNA中的rRNA可采用本领域的常规方法或试剂盒进行去除，可以保留除带有polyA尾外的RNA外的其他类型的RNA(如circularRNA，非polyA尾的noncodingRNAs)；优选为采用Ribo-offTMrRNAdepletionkit(Human/Mouse/Rat)(诺唯赞)试剂盒去除rRNA。步骤(2)中所述的RNA片段I的质量为≥100ng；优选为≥200ng。步骤(2)中所述的RNA片段II的质量为≥10ng；优选为≥50ng。步骤(3)中所述的热变性处理条件为：75℃处理5min，然后置于冰上2～3min。步骤(3)中所述的特异识别m6A位点的抗体为m6A抗体(m6Aantibody)；优选为从Abcam公司购买得到m6A抗体。步骤(3)中所述的交联的条件优选为：150～400mj/cm2，254nm的UV交联2～4次；更优选为：150mj/cm2，254nm的UV交联4次。步骤(3)中所述的免疫共沉淀的条件优选为：4℃孵育2h。步骤(4)①中所述的电泳分离为采用4％～12％的NuPAGE进行分离。步骤(4)①中所述的NaCl的用量为按其在所述反应体系的终浓度为45～55nmol/L添加计算；优选为按其在所述反应体系的终浓度为50nmol/L添加计算。步骤(4)①中所述的PEG8000优选为浓度为质量体积比50％的PEG8000溶液(即100ml水含有50g的PEG8000)。步骤(4)①中所述的PEG8000的用量为按其在所述反应体系的终浓度为0.04～0.06g/ml添加计算(即按终浓度4～6％(w/v)添加)；优选为按其在所述反应体系的终浓度为质量百分比0.05g/ml(即按终浓度5％(w/v)添加)添加计算。步骤(4)①中所述的电泳时，可以以未交联的复合体(即步骤(3)中得到的反应液)为对照，用于区分变性不完全导致的假阳性。步骤(4)中所述的接头连接所用的T4RNA连接酶为T4RNALigase1,HighConcentration。所述的T4RNA连接酶的用量本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高通量高灵敏度单碱基分辨率检测RNA m6A的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)制备去rRNA的RNA样品/n提取样品中的总RNA，然后去除总RNA中的rRNA，得到RNA样品；/n(2)RNA片段化/n将步骤(1)中得到的RNA样品进行片段化处理，得到RNA片段，并将RNA片段分成2份，命名为RNA片段I和RNA片段II；/n(3)免疫共沉淀及交联/n将步骤(2)中得到的RNA片段I进行热变性处理，然后与特异识别m6A位点的抗体进行反应，得到反应液；再将反应液在紫外条件下进行交联，得到交联复合体；将protein A/Gbeads加入到交联复合体进行免疫共沉淀，得到免疫共沉淀产物；其中，交联的条件为：150～1500mj/cm

【技术特征摘要】
1.一种高通量高灵敏度单碱基分辨率检测RNAm6A的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备去rRNA的RNA样品
提取样品中的总RNA，然后去除总RNA中的rRNA，得到RNA样品；
(2)RNA片段化
将步骤(1)中得到的RNA样品进行片段化处理，得到RNA片段，并将RNA片段分成2份，命名为RNA片段I和RNA片段II；
(3)免疫共沉淀及交联
将步骤(2)中得到的RNA片段I进行热变性处理，然后与特异识别m6A位点的抗体进行反应，得到反应液；再将反应液在紫外条件下进行交联，得到交联复合体；将proteinA/Gbeads加入到交联复合体进行免疫共沉淀，得到免疫共沉淀产物；其中，交联的条件为：150～1500mj/cm2，254nm的UV交联2～4次；
(4)RNA接头连接
①将步骤(3)中得到的免疫共沉淀产物进行RNA3′末端荧光标记接头连接，连接后洗去多余的接头，变性洗脱，电泳分离，得到交联的连接产物；然后在交联的连接产物中加入蛋白酶K进行消化，消化后用silane磁珠、以及NaCl或PEG8000中的至少一种对RNA进行回收，得到纯化后的RNA；
②将步骤(2)中得到的RNA片段II进行RNA3′末端接头连接并进行回收，得到接头连接后的RNA；
(5)建库
将步骤(4)①中得到的纯化后的RNA逆转录成cDNA，然后将cDNA进行3′末端接头连接，得到接头连接后的cDNA；再将接头连接后的cDNA进行PCR扩增，纯化，得到PCR产物，即构建得到hmCLIP文库；再将步骤(4)②中得到的接头连接后的RNA替代步骤(4)①中得到的纯化后的RNA，按相同的操作步骤，构建得到input文库；
(6)测序
将步骤(5)中构建得到的hmCLIP文库和input文库利用高通量测序平台进行测序。


2.根据权利要求1所述的高通量高灵敏度单碱基分辨率检测RNAm6A的方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的样品为细胞、组织或病理切片石蜡标本。


3.根据权利要求1所述的高通量高灵敏度单碱基分辨率检测RNAm6A的方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的接头连接所用的T4RNA连接酶为T4RNALigase1,HighConcentration；
所述的T4RNA连接酶的用量为按其在所述反应体系的终浓度为2000U/ml添加计算。


4.根据权利要求1所述的高通量高灵敏度单碱基分辨率检测RNAm6A的方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的RNA3′末端荧光标记接头序列如下所示：
/5Phos/AUAUAGGNNNNNAGAUCGGAAGAGCGUCGUGUAG/3AzideN/；
步骤(5)中所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹东，汪颜杰，廖建友，
申请(专利权)人：中山大学孙逸仙纪念医院，
类型：发明
国别省市：广东;44