可检测的目标核酸、探针、确定胎儿F8基因单体型的方法及应用技术

本发明专利技术涉及生物信息领域，具体涉及一种可检测的目标核酸，探针，F8基因相关目标区域捕获文库的构建方法以及确定胎儿目标区域单体型的方法和装置。所述可检测的目标核酸包括F8基因全部外显子区、前导区和尾部区；以及F8基因上下游1M区域中次等位碱基频率为0.3～0.5的SNP位点。利用该目标区域设计的探针，探针较小，易于捕获。利用探针构建F8基因相关目标区域捕获文库或者确定胎儿目标区域单体型，能够实现准确性测定。

【技术实现步骤摘要】
可检测的目标核酸、探针、确定胎儿F8基因单体型的方法及应用
本专利技术涉及生物信息领域，具体涉及一种可检测的目标核酸、探针、确定胎儿F8基因单体型的方法及应用。
技术介绍
血友病(Hemophilia)为一种先天性血液凝固异常的遗传疾病，依据缺乏的凝血因子种类不同，主要分为A型、B型等，A型血友病约占血友病80％-85％，致病原因是第八凝血因子(Factor8，简称F8)基因异常，B型血友病约占15-20％，致病原因是第九凝血因子(Factor9，简称F9)基因异常。血友病A(HemophiliaA，简称HA，OMIM#306700)患者缺乏第八凝血因子(F8)，无法凝血。F8基因位于染色体Xq28上，属于X连锁隐形遗传，全长186kb，由26个外显子和25个内含子组成。导致HA的基因突变种类繁多，呈高度异质性。其中重型HA多由大的DNA片段缺失、到位或插入等引起，50％-51％是由int22倒位或int1到位引起，由SNP/Indel引起的在男女患者的比例分别为49％和43％，另外还有6％的患者是因为外显子/整个基因缺失重复引起。而在中度血友病A患者中，主要是由于SNP/Indel以及外显子/整个基因缺失重复引起的。血友病A患者多为男性，目前仍无法治愈，需终生注射补充凝血因子。依据第八凝血因子活性高低，可以区分成轻度(5-35％)、中度(1-5％)及重度(＜1％)。血友病的严重程度因人而异，轻度血友病患者只有在严重创伤或手术时才会有出血的问题。中度血友病患者较不常出血，也许一个月出血一次，出血通常是遭受创伤，也有部分患者可能自发性出血。重度血友病患者时常发生肌肉或关节出血，他们可能每周出血一至两次，出血通常是自发性的，此型患者，没有任何明显的原因，但还是发生出血的情形。目前我国对于血友病一般采取家族史、临床表现以及基因诊断等才能确诊。这种方法需要有患者的临床表现以及DNA样本，而对于新生儿来说往往要在出生以后几个月内或者更晚的时间才能确诊。这种方法不但给新出生的孩子带来了痛苦，更让整个家庭承受着巨大的精神及其物质压力。目前我国对F8的产前诊断建立在羊膜腔穿刺、绒毛吸取等侵入性基础上进行的细胞遗传学诊断，虽然诊断准确，但因其属于侵入性检查，操作有创伤性，易引起宫内感染、流产、甚至对胎儿产生影响。随着孕妇外周血浆中胎儿游离DNA存在的发现，为无创产前检测胎儿基因型提供了可能。然后对于胎儿血友病的筛查方法，还需要进一步改进。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种确定胎儿F8基因单体信息的方法和装置。我们基于高通量测序技术平台和目标区域捕获技术，采用家系致病单体型连锁分析的方法，通过连锁分析从孕妇外周血浆DNA测序数据中推断胎儿的单体型信息，该方法通过利用连锁单体型信息极大的降低了假阳性及假阴性的发生。本专利技术所提供的方法，利用特异性SNP位点进行胎儿含量准确定量，避免传统方法定量不准造成的错误诊断的可能性。而且由于取样方式的无创性，避免珍贵儿流程风险，减少孕妇心里和身体痛苦。较小的探针捕获区域约110.08kb，极大了降低了测序和探针的成本。具体而言，本专利技术提供了如下技术方案：根据本专利技术的第一方面，本专利技术提供了一种可检测的目标核酸，包括：F8基因全部外显子区、前导区和尾部区；以及F8基因上下游1M区域中次等位碱基频率为0.3～0.5的SNP位点。本文中“可检测的目标核酸”是指可以通过任何手段可以检测目标核酸，例如可以通过对含有目标核酸的基因组DNA进行高通量测序，然后特异性性检测目标核酸的核酸序列，例如也可以通过探针捕获目标区域，然后通过高通量测序检测目标区域的核酸序列。根据本专利技术的第二方面，本专利技术提供了一种探针，所述探针游离于溶液中或者固定在芯片上，所述探针用于捕获权利要求1所述的目标区域。本方法利用定制的，小捕获探针，极大降低了测序成本，便于临床推广。在本专利技术的一些实施例中，所述探针的GC含量为40～50％。根据本专利技术的实施例，本专利技术提供了一种构建F8目标区域文库的方法，包括：从待测样本中获得基因组DNA，打断得到200～300bp的小片段DNA；将所述小片段DNA进行末端补平，3’端加碱基A，与3’端带有甲基T的接头连接，获得连接产物；对所述连接产物进行PCR扩增，获得非特异性捕获文库；利用探针对所述非特异性捕获文库中目标区域进行特异性捕获，经PCR扩增获得目标区域捕获文库；其中所述目标区域为本专利技术第一方面所述的目标区域。在本专利技术的一些实施例中，所述探针为本专利技术第二方面所述的探针。根据本专利技术的第四方面，本专利技术提供了一种确定胎儿目标区域单体型的方法，包括：对孕妇体液中游离核酸的所述目标区域进行序列测定，以便获得第一测序数据；对所述胎儿的家系成员的所述目标区域进行序列测定，以便获得第二测序数据、第三测序数据和第四测序数据，其中，所述第二测序数据为胎儿母亲的测序数据，所述第三测序数据为胎儿父亲的测序数据，所述第四测序数据为先证者的测序数据；基于所述第一测序数据和第二测序数据，确定所述孕妇体液中的胎儿核酸含量；基于所述第二测序数据、第三测序数据和第四测序数据，分别构建所述胎儿母亲的目标区域单体型和所述胎儿父亲的目标区域单体型；以及基于所述胎儿母亲的目标区域单体型、所述胎儿父亲的目标区域单体型以及所述胎儿核酸含量，确定所述胎儿的目标区域单体型；其中所述目标区域为本专利技术第一方面所述的目标区域。本技术方案通过利用家系连锁单体型分析策略，对血浆游离DNA进行测序分析胎儿F8基因单体型信息。本方法利用特异性SNP对血浆胎儿DNA含量准确定量，极大的避免由于单个位点测量比例不准，单个位点测序错误等方面带来的假阴性和假阳性结果,使得检测结果更加准确可靠。根据本专利技术的实施例，以上所述的方法可以进一步包括如下技术特征：在本专利技术的一些实施例中，所述方法用于非诊断目的。以上确定胎儿目标区域单体型的方法可以用作科研或者其他商业用途。在本专利技术的一些实施例中，所述孕妇体液中游离核酸包括孕妇血浆游离DNA。在本专利技术的一些实施例中，对孕妇体液中游离核酸的所述目标区域进行序列测定包括：利用探针对所述游离核酸进行捕获，所述探针特异性识别所述目标区域。在本专利技术的一些实施例中，所述探针是以芯片形式提供的。在本专利技术的一些实施例中，所述探针为本专利技术第二方面所述的探针。在本专利技术的一些实施例中，所述胎儿核酸含量是通过下列步骤确定的：确定所述第一测序数据和所述第二测序数据中预定位点的基因型组合，所述预定位点在所述第一测序数据中存在两种基因型，并且所述预定位点在所述第二测序数据中只存在一种基因型，其中，所述基因型组合选自下列组合之一：(iii)在所述第二测序数据中只存在纯合基因型RR，在所述第一测序数据中存在纯合基因型RR和杂合基因型Rr，其中，R和r表示一对等位基因，(iv)在所述第二测序数据中只存在杂合基因型Rr，在所述第一测序数据本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可检测的目标核酸，其特征在于，包括：/nF8基因全部外显子区、前导区和尾部区；/n以及F8基因上下游1M区域中次等位碱基频率为0.3～0.5的SNP位点。/n

【技术特征摘要】
1.一种可检测的目标核酸，其特征在于，包括：
F8基因全部外显子区、前导区和尾部区；
以及F8基因上下游1M区域中次等位碱基频率为0.3～0.5的SNP位点。


2.一种探针，所述探针游离于溶液中或者固定在芯片上，其特征在于，所述探针用于捕获权利要求1所述的目标核酸；
任选地，所述探针的GC含量为40～50％。


3.一种F8基因相关目标区域捕获文库的构建方法，其特征在于，包括：
从待测样本中获得基因组DNA，打断得到200～300bp的小片段DNA；
将所述小片段DNA进行末端补平，3’端加碱基A，与3’端带有甲基T的接头连接，获得连接产物；
对所述连接产物进行PCR扩增，获得非特异性捕获文库；
利用探针对所述非特异性捕获文库中目标区域进行特异性捕获，经PCR扩增获得目标区域捕获文库；
其中所述目标区域为权利要求1所述的目标核酸；
任选地，所述探针为权利要求2所述的探针。


4.一种确定胎儿目标区域单体型的方法，其特征在于，包括：
对孕妇体液中游离核酸的所述目标区域进行序列测定，以便获得第一测序数据；
对所述胎儿的家系成员的所述目标区域进行序列测定，以便获得第二测序数据、第三测序数据和第四测序数据，其中，所述第二测序数据为胎儿母亲的测序数据，所述第三测序数据为胎儿父亲的测序数据，所述第四测序数据为先证者的测序数据；
基于所述第一测序数据和第二测序数据，确定所述孕妇体液中的胎儿核酸含量；
基于所述第二测序数据、第三测序数据和第四测序数据，分别构建所述胎儿母亲的目标区域单体型和所述胎儿父亲的目标区域单体型；以及
基于所述胎儿母亲的目标区域单体型、所述胎儿父亲的目标区域单体型以及所述胎儿核酸含量，确定所述胎儿的目标区域单体型；
其中所述目标区域为权利要求1所述的目标核酸。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法用于非诊断目的；
任选地，所述孕妇体液中游离核酸包括孕妇血浆游离DNA。


6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，对孕妇体液中游离核酸的所述目标区域进行序列测定包括：
利用探针对所述游离核酸进行捕获，所述探针特异性识别所述目标区域；
任选地，所述探针是以芯片形式提供的；
任选地，所述探针为权利要求2所述的探针。


7.根据权利要求4～6中任一项所述的方法，其特征在于，所述胎儿核酸含量是通过下列步骤确定的：
确定所述第一测序数据和所述第二测序数据中预定位点的基因型组合，所述预定位点在所述第一测序数据中存在两种基因型，并且所述预定位点在所述第二测序数据中只存在一种基因型，其中，所述基因型组合选自下列组合之一：
(i)在所述第二测序数据中只存在纯合基因型R...

【专利技术属性】
技术研发人员：何志晖，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：广州医科大学附属第一医院，深圳华大生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44