环状RNA 0089762的检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及环状RNA 0089762的检测试剂盒，所述试剂盒包含环状RNA 0089762的检测试剂，所述环状RNA 0089762的序列为SEQ ID NO.1；所述检测试剂包括扩增环状RNA 0089762的引物一对，所述引物包括上游引物如SEQ ID NO.2和下游引物如SEQ ID NO.3；本发明专利技术还提供环状RNA 0089762的检测试剂盒，所述试剂盒包含环状RNA 0089762的检测试剂；所述检测试剂包括地高辛标记的寡核苷酸探针如Probe 1，并将环状RNA 0089762的检测试剂盒应用于非酒精性脂肪性肝病的临床诊断中。

【技术实现步骤摘要】
环状RNA0089762的检测试剂盒及其应用
本专利技术涉及生物医学
，具体涉及环状RNA0089762的检测试剂盒及其在非酒精性脂肪性肝病中的应用。
技术介绍
非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是指除酒精外的其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，包括非酒精性单纯性脂肪肝（simplesteatosis）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）及其相关肝硬化（cirrhosis）。近年来，随着人们生活习惯和饮食结构的改变，非酒精性脂肪性肝病的患病率日益增高，我国已经达到15.35%，且呈不断升高趋势；在西方国家更是高达20-25%，已成为第一大肝病；NAFLD与肥胖、糖尿病、高脂血症等代谢性疾病密切相关。非酒精性单纯性脂肪肝是一种良性疾病，但NASH却可逐渐进展为肝硬化、肝癌等终末期肝病。回顾研究发现，NASH患者中41％的病人可以发展为肝纤维化，5.4％的病人进展为终末期肝病甚至肝癌。此外，由于脂变肝脏对很多药物和毒物的敏感性增加，增加了临床用药风险；再者，NAFLD可通过加剧机体代谢紊乱促进糖尿病、冠心病等的发展，导致代谢综合征相关肿瘤及心血管事件的高发；如果脂变肝脏作为供体，会引起移植后肝脏原发性无功能而导致移植失败，因此，加强NAFLD发病机制研究和发现新的防治手段迫在眉睫。环状RNA是一种特殊的内源性非编码RNA，是继微小RNA及长链非编码RNA后RNA家族的又一研究热点。近年来，随着RNA测序技术和生物信息学的迅速发展，人们通过分析大规模转录组数据发现环状RNA大量存在，约占真核细胞转录本的10%，相较于miRNA和长链非编码RNA，环状RNA具有较为显著的一些特性，如：具有环状闭合结构，无polyA尾巴，不易被核酸外切酶降解，能够更加稳定地存在于真核细胞中，且序列多数高度保守，具有一定的组织结构特异性，使得环状RNA在基因表达及其他生物学过程中占据重要地位。环状RNA与多种疾病密切相关，在疾病的发生发展过程中起着至关重要的调控作用，因此，环状RNA在未来可能会成为一种高效能的临床诊断标志物。最近有研究证实，一种环状RNA与NAFLD有着紧密联系，NAFLD患者肝成纤维细胞内线粒体定位的环状RNA0089762表达显著下调，故环状RNA0089762可作为NAFLD的分子靶标。
技术实现思路
本专利技术提供了环状RNA0089762的检测试剂盒，并将其应用于NAFLD患者诊断，为临床诊断提供新思路。本专利技术采用的技术方案如下：在第一个方面，本专利技术提供一种环状RNA0089762的检测试剂盒，所述试剂盒包含环状RNA0089762的检测试剂，所述环状RNA0089762的序列为SEQIDNO.1。进一步地，所述环状RNA0089762的检测试剂包括扩增环状RNA0089762的引物一对，所述引物包括上游引物如SEQIDNO.2和下游引物如SEQIDNO.3，其中，SEQIDNO.2：GCTGCATGTGCCATGTCGCC；SEQIDNO.3：GGCCACCAATGGTACTGAACC。在第二个方面，本专利技术提供环状RNA0089762的检测试剂盒通过qRT-PCR方法应用于非酒精性脂肪性肝病的临床诊断。在第三个方面，本专利技术还提供了一种环状RNA0089762的检测试剂盒，所述检测试剂包括地高辛标记的寡核苷酸探针如Probe1，其中，Probe1：DIG-CCTAGAACCAGGCGACATGGCACATGCAGCGC-DIG。在第四个方面，本专利技术还提供了一种环状RNA0089762的检测试剂盒通过Northernblotting或荧光原位杂交方法应用于非酒精性脂肪性肝病的临床诊断。本专利技术与现有技术相比，具有如下有益效果：1、本专利技术通过设计针对于环状RNA0089762的引物和探针并利用其制备环状RNA0089762的检测试剂盒，首先，分别设计了针对环状RNA0089762的引物和针对线性RNA0089762的引物进行qRT-PCR，其次，分别设计了针对环状RNA0089762和同时针对环状及线性RNA0089762的地高辛标记的寡核苷酸探针进行Northernblotting和荧光原位杂交，最终证实了环状RNA0089762的真实存在以及在非酒精性脂肪性肝病诊断方面的适用性。2、本专利技术提供一种环状RNA0089762的检测试剂盒，通过设计合成的引物和探针，利用qRT-PCR、Northernblotting以及FISH等方法有效检测到非酒精性脂肪性肝病患者肝成纤维细胞内线粒体定位的环状RNA0089762表达明显下调，因此，环状RNA0089762可作为非酒精性脂肪性肝病的分子靶标，可有效应用于非酒精性脂肪性肝病患者，为其临床诊断提供新思路。附图说明图1为经过本专利技术实施例1检测后在有和没有RNaseR处理的情况下正常人和NASH患者的每个成纤维细胞内环状RNA0089762和线性RNA0089762的拷贝数变化示意图；图2为经过本专利技术实施例1检测后在有和没有RNaseR处理的情况下正常人和NASH患者的成纤维细胞的线粒体内和胞浆内环状RNA0089762表达量变化示意图；图3为本专利技术实施例2中针对环状RNA0089762设计的地高辛标记的寡核苷酸探针Probe1以及同时针对环状和线性RNA0089762设计的地高辛标记的寡核苷酸探针Probe2的示意图；图4为经过本专利技术实施例2检测后在转染和未转染环状RNA0089762过表达载体、有和没有RNaseR处理的情况下，NASH患者成纤维细胞中环状和线性RNA0089762的表达量比对示意图；图5为经过本专利技术实施例3检测后正常人、非酒精性单纯性脂肪肝患者、非酒精性脂肪性肝炎伴轻度肝纤维化患者以及非酒精性脂肪性肝炎肝硬化患者的成纤维细胞中环状RNA0089762的表达量比对示意图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例来对专利技术进行详细的说明。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1本专利技术提供环状RNA0089762的检测试剂盒，所述试剂盒包含环状RNA0089762的检测试剂；所述环状RNA0089762的序列为SEQIDNO.1。进一步地，所述检测试剂包括扩增环状RNA0089762的引物一对，所述引物包括上游引物如SEQIDNO.2和下游引物如SEQIDNO.3，其中，SEQIDNO.2和SEQIDNO.3的序列为：SEQIDNO.2：GCTGCATGTGCCATGTCGCC；SEQIDNO.3：GGCCACCAATGGTACTGAACC。本实施例中还针对线性RNA0089762设计引物SEQIDNO.4和SEQIDNO.5，针对线性RNA0089762设计引物的目的是与环状RNA0089762进行比较，验证环状RNA0089762不易被RNaseR降解的特性，证实环状本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种环状RNA 0089762的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含环状RNA0089762的检测试剂，所述环状RNA 0089762的序列为SEQ ID NO.1。/n

【技术特征摘要】
1.一种环状RNA0089762的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含环状RNA0089762的检测试剂，所述环状RNA0089762的序列为SEQIDNO.1。


2.如权利要求1所述的一种环状RNA0089762的检测试剂盒，其特征在于：所述环状RNA0089762的检测试剂包括扩增环状RNA0089762的引物一对，所述引物包括上游引物如SEQIDNO.2和下游引物如SEQIDNO.3，其中，
SEQIDNO.2：GCTGCATGTGCCATGTCGCC；
SEQIDNO.3：GGCCACCAATGGTACTGAACC。
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【专利技术属性】
技术研发人员：赵绮毅，刘嘉煜，马瑞颖，
申请(专利权)人：中山大学附属第三医院，
类型：发明
国别省市：广东;44