人COL1A1和/或COL1A2基因的扩增、检测突变用引物及其试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了人COL1A1和/或COL1A2基因的扩增、检测突变位点用引物及其试剂盒，属于基因检测技术领域。检测人COL1A1和/或COL1A2基因DNA突变的试剂盒，包括用于检测COL1A1与COL1A2基因第1至第52外显子突变的测序引物组。采用特异性引物组，针对COL1A1和COL1A2基因的第1～52外显子进行突变检测，确保了测定结果的准确性与特异性，针对COL1A1与COL1A2基因突变所导致的成骨不全I‑IV型、爱莱尔‑当洛综合征、卡菲氏病、成骨不全与爱莱尔‑当洛综合征合并症等遗传性疾病进行基因检测，可用于COL1A1与COL1A2基因基因突变相关联的复杂疾病的基因检测。

【技术实现步骤摘要】
人COL1A1和/或COL1A2基因的扩增、检测突变用引物及其试剂盒
本专利技术属于基因检测
，具体涉及人COL1A1和/或COL1A2基因的扩增、检测突变用引物及其试剂盒。
技术介绍
胶原蛋白(Collagen)是一类重要的蛋白质。随着生物化学、分子生物学和细胞生物学技术的发展，目前已发现有27种不同类型的胶原，按照被发现的先后顺序分别称为I型胶原、II型胶原、III型胶原等。胶原通常由3条α-肽链组成，有些胶原分子的3条肽链是相同的，有些是不同的。按照国际惯例，胶原分子的3条肽链被称为α1-链、α2-链、α3-链。如果两种胶原相互叠加，那么在命名上附带上大写罗马数字，并用括号括起来，例如III型胶原的α1-链，称为α1(III)，α2-链称为α2(III)。从功能方面分类，可以将胶原划分为两组，一组胶原是成纤维胶原，另一组是非成纤维胶原。I、II、III、IV、XXIV和XXVII型胶原都是成纤维胶原，其余的都是非成纤维胶原。然而非成纤维胶原也可以细分为6种：①FACIT(纤维结合的胶原，具有中断的三股螺旋)族胶原，包括IX、XII、XIV、XVI、XX和XXI；②网状结构胶原，包括IV、VIII和X型胶原；③念珠状原纤维胶原，VI型胶原即属于这一种；④锚定原纤维或纤丝胶原，包括VII和XVII型胶原；⑤跨膜区胶原，包括XIII、XXIII和XXV型胶原；⑥结构尚未明确的胶原，包括XV、XVIII、XXII和XXVI型胶原。I型胶原蛋白由三条肽链组成，其中有两条α1-链，一条α2-链构成。在机体内分布广泛，是皮肤、骨骼、肌腱、角膜等重要组成成分。COL1A1与COL1A2基因分别编码前α1-链与前α2-链。COL1A1或COL1A2基因突变与诸多遗传性骨病相关，如成骨不全(osteogenesisimperfecta，OI)，爱莱尔-当洛综合征(Ehlers-Danlossyndrome，cvEDS)、卡菲氏病或婴儿骨皮质增生症(Caffeydisease，infantilecorticalhyperostosis，ICH))等。成骨不全是一种胶原合成代谢障碍所导致的遗传性结缔组织罕见疾病。主要临床表型包括骨质疏松和骨的脆性增加、蓝巩膜、牙本质不全，早熟性耳硬化等症状。其中，I～IV型成骨不全是由于COL1A1或COL1A2基因突变所导致的常染色体显性遗传疾病。其中I型临床症状较轻，患者不骨折或有少数骨折史，肢体不变形。II型患者通常在围产期死亡，是最为严重的类型。III型患者因频繁骨折、肢体畸形、身材矮小。IV型为中等程度的成骨不全，介于I型与III型之间，骨折次数较少，通常不引起畸形。心脏瓣膜型EDS(Cardiac-valvulartypeEhlers-Danlossyndrome，cvEDS)具有心脏瓣膜缺损，关节活动过度、皮肤弹性强，薄弱，易形成疤痕，具有腹股沟疝，胸廓畸形，关节脱位及足部畸形等特征，该类型EDS主要是由于双等位COL1A2基因突变所致。关节松弛型EDS(ThearthrochalasiatypeEhlers-Danlossyndrome，aEDS)主要特征为髋脱位，关节松弛普遍，且多脱位或半脱位，皮肤易于拉伸。另外，组织脆性、易产生淤伤、肌肉张力降低、后凸畸形及骨量减少等也是该病的特征。OI/EDS疾病同时具有成骨不全以及爱菜尔-当洛综合征疾病的特征，突变多多发生在I型胶原蛋白氨基端与羧基端。卡菲氏病又名婴儿骨皮质增生症，主要是由于COL1A1基因c.3040C＞T(p.Arg836Cys)基因突变所致。主要特征是骨质增生，骨骼异常主要影响下颌骨、肩胛骨、锁骨以及胳膊和腿部的长骨骨干等部位，该病常发于婴儿5个月前，通常会在2周岁内症状自动恢复正常。COL1A1或COL1A2基因的DNA位点突变常常导致疾病的发生，因此，采用基因检测手段了解COL1A1或COL1A2基因位点的发生突变，对疾病的辅助诊断具有重要临床意义。但是由于COL1A1或COL1A2基因全序列十分长，缺乏有效的扩增COL1A1或COL1A2基因长片段的引物，同时现有技术中关于COL1A1或COL1A2基因的突变位点的检测通常单一突变位点的检测，导致检测结果不全面有遗漏的情况，且产生测定结果的准确性与特异性不高的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种人COL1A1基因或人COL1A2基因扩增用引物组，极大的避免了针对单个外显子进行扩增的多次PCR反应，减少了PCR反应数量。本专利技术专利技术的目的还在于提供一种检测人COL1A1基因或人COL1A2基因突变位点的引用组，确保了测定结果全面且准确，同时具有与检测片段高特异性结合能力。本专利技术提供了人COL1A1基因的扩增用引物组，包括两对引物：扩增COL1A1基因1～25外显子与内含子的引物为核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的上游引物FP1和核苷酸序如SEQIDNO.2所示的下游引物RP1；扩增COL1A1基因26～52外显子与内含子的引物为核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的上游引物FP2与核苷酸序如SEQIDNO.4所示的下游引物RP2。本专利技术提供了检测人COL1A1基因的DNA突变用引物组，包括如SEQIDNO.1、SEQIDNO.5～SEQIDNO.33所示的15对检测COL1A1基因第1至第52外显子的引物。本专利技术提供了人COL1A2基因的扩增用引物组，包括三对引物：扩增COL1A2基因1～12外显子与内含子用引物为核苷酸序列如SEQIDNO.34所示的上游引物FP18和核苷酸序列如SEQIDNO.35所示的下游引物RP18；扩增COL1A2基因13～34外显子与内含子用引物为核苷酸序列如SEQIDNO.36所示的引物FP19和核苷酸序列如SEQIDNO.37所示的下游引物RP19；扩增COL1A2基因35～52外显子与内含子用引物为核苷酸序列如SEQIDNO.38所示的上游引物FP20和核苷酸序列如SEQIDNO.39所示的下游引物RP20。本专利技术提供了检测COL1A2基因DNA突变用引物组，包括如SEQIDNO.34、SEQIDNO.40～SEQIDNO.100所示的31对用于COL1A2基因第1至第52外显子与内含子的测序的引物；本专利技术提供了一种检测COL1A1和COL1A2基因突变位点的试剂盒，包括所述人COL1A1基因DNA突变用引物组和所述检测COL1A2基因DNA突变用引物组。优选的，还包括DNA测序试剂；所述DNA测序试剂包括BigDye3.1混合液、EDTA溶液、无水乙醇、体积浓度75％乙醇水溶液和Hi-Di甲酰胺。优选的，还包括权利要求1所述引物组和权利要求3所述引物组。优选的，还包括PCR扩增试剂；所述PCR扩增试剂包括dNTPMix、含Mg2+的2×PhantaMaxBuffer和DNA聚合酶。优选的，还包括PCR产物纯化试剂；所述PCR产物纯化试剂包括SAP酶和ExoI酶。本专利技术提供了所述扩增CO本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.人COL1A1基因的扩增用引物组，其特征在于，包括两对引物：扩增COL1A1基因第1～25外显子与内含子的引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物FP1和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物RP1；/n扩增COL1A1基因第26～52外显子与内含子的引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物FP2与核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物RP2。/n

【技术特征摘要】
1.人COL1A1基因的扩增用引物组，其特征在于，包括两对引物：扩增COL1A1基因第1～25外显子与内含子的引物为核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的上游引物FP1和核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的下游引物RP1；
扩增COL1A1基因第26～52外显子与内含子的引物为核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的上游引物FP2与核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的下游引物RP2。


2.检测人COL1A1基因DNA突变用引物组，其特征在于，包括如下15对检测COL1A1基因第1～52外显子的引物；
用于外显子1的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的上游引物FP1和核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的下游引物RP3；
用于外显子2～5的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQIDNO.6所示的上游引物FP4和核苷酸序列如SEQIDNO.7所示的下游引物RP4；
用于外显子6～8的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQIDNO.8的上游引物FP5和核苷酸序列如SEQIDNO.9的下游引物RP5；
用于外显子9～11的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQIDNO.10的上游引物FP6和核苷酸序列如SEQIDNO.11的下游引物RP6；
用于外显子12～16的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQIDNO.12的上游引物FP7和核苷酸序列如SEQIDNO.13的下游引物RP7；
用于外显子17～20的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQIDNO.14的上游引物FP8和核苷酸序列如SEQIDNO.15的下游引物RP8；
用于外显子21～25的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQIDNO.16的上游引物FP9和核苷酸序列如SEQIDNO.17的下游引物RP9；
用于外显子26～29的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQIDNO.18的上游引物FP10和核苷酸序列如SEQIDNO.19的下游引物RP10；
用于外显子30～32的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQIDNO.20的上游引物FP11和核苷酸序列如SEQIDNO.21的下游引物RP11；
用于外显子33～36的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQIDNO.22的上游引物FP12和核苷酸序列如SEQIDNO.23的下游引物RP12；
用于外显子37～40的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQIDNO.24的上游引物FP13和核苷酸序列如SEQIDNO.25的下游引物RP13；
用于外显子41～44的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQIDNO.26的上游引物FP14和核苷酸序列如SEQIDNO.27的下游引物RP14；
用于外显子45～47的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQIDNO.28的上游引物FP15和核苷酸序列如SEQIDNO.29的下游引物RP15；
用于外显子48～50的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQIDNO.30的上游引物FP16和核苷酸序列如SEQIDNO.31的下游引物RP16；
用于外显子51～52的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQIDNO.32的上游引物FP17和核苷酸序列如SEQIDNO.33的下游引物RP17。


3.人COL1A2基因的扩增用引物组，其特征在于，包括三对引物：
扩增COL1A2基因第1～12外显子与内含子用引物为核苷酸序列如SEQIDNO.34所示的上游引物FP18和核苷酸序列如SEQIDNO.35所示的下游引物RP18；
扩增COL1A2基因第13～34外显子与内含子用引物为核苷酸序列如SEQIDNO.36所示的引物FP19和核苷酸序列如SEQIDNO.37所示的下游引物RP19；
扩增COL1A2基因第35～52外显子与内含子用引物为核苷酸序列如SEQIDNO.38所示的上游引物FP20和核苷酸序列如SEQIDNO.39所示的下游引物RP20。


4.检测COL1A2基因DNA突变用引物组，其特征在于，包括如下31对用于COL1A2基因第1～52外显子与内含子的测序引物；
用于外显子1的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQIDNO.34所示的上游引物FP18和核苷酸序列如SEQIDNO.40所示的下游引物RP21；
用于外显子2的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQIDNO.41的上游引物FP22和核苷酸序列如SEQIDNO.42的下游引物RP22；
用于外显子3～4的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQIDNO.43的上游引物FP23和核苷酸序列如SEQIDNO.44的下游引物RP23；
用于外显子5的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQIDNO.45的上游引物FP24和核苷酸序列如SEQIDNO.46的下游引物RP24；
用于外显子6的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQIDNO.47的上游引物FP25和核苷酸序列如SEQIDNO.48的下游引物RP25；
用于外显子7～10的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQIDNO.49的上游引物FP26和核苷酸序列如SEQIDNO.50的下游引物RP26；
用于外显子11～12的PCR双向测序引物为核苷酸序列如SEQIDNO.51的上游引物FP27和核苷酸序列如SEQIDNO...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲁艳芹，韩金祥，张磊亮，王延宙，任秀智，彭传明，岳笑然，
申请(专利权)人：山东第一医科大学山东省医学科学院，
类型：发明
国别省市：山东;37