全基因组且靶向的单体型重构制造技术

本发明专利技术涉及用于单体型确定的方法，且具体的是在全基因组水平的单体型确定以及靶向单体型确定。

【技术实现步骤摘要】
全基因组且靶向的单体型重构本申请是基于申请日为2014年7月18日，优先权日为2013年7月19日，申请号为201480051354.7，专利技术名称为：“全基因组且靶向的单体型重构”的专利申请的分案申请。对相关申请的交叉引用本申请要求2013年7月19日提交的美国临时申请号61/856,486和2013年9月4日提交的美国临时申请号61/873,671的优先权。所述申请的内容通过提述以其整体并入本文。专利
本专利技术涉及用于单体型确定，且特别是在全基因组水平的单体型确定，以及靶向单体型确定的方法。专利技术背景DNA鸟枪法测序技术的快速进步使得能够系统性鉴定个体的遗传变体(Wheeler等，Nature452,872-876(2008)；Pushkarev等，NatureBiotechnology27,847-850(2009)；Kitzman等，ScienceTranslationalMedicine4,137ra176(2012)；和Levy等，PlosBiology5,e254(2007))。然而，由于人类基因组由同源的两组染色体组成，了解个体真正的遗传组成要求描绘遗传材料的母本和父本拷贝，或单体型(haplotype)。在个体中获得单体型的效用可以有几重：首先，单体型在临床上对于器官移植中供体-受体匹配结果的预测有用(Crawford等，AnnualReviewOfMedicine56,303-320(2005)和Petersdorf等，PLoSMedicine4,e8(2007))并越来越多地用作检测疾病相关性的方法(Studies等，Nature447,655-660(2007)；Cirulli等，NatureReviews.Genetics11,415-425(2010)；和Ng等，NatureGenetics42,30-35(2010))。第二，在表现出复合杂合性(compoundheterozygosity)的基因中，单体型提供了关于两种有害变体是否定位于相同的或不同的等位基因上的信息，这极大地影响了这些变体的遗传是否有害的预测(Musone等，NatureGenetics40,1062-1064(2008)；和Erythematosus等，NatureGenetics40,204-210(2008)；和Zschocke,JournalofInheritedMetabolicDisease31,599-618(2008))。在复杂的基因组(例如人)中，复合杂合性可能涉及在非编码顺式调节位点处的遗传或表观遗传变异，所述非编码顺式调节位点定位于远离它们调节的基因(Sanyal等，Nature489,109-113(2012))，这强调了获得染色体跨度(chromosome-span)的单体型的重要性。第三，来自个体组的单体型提供了关于群体结构的信息(InternationalHapMap,C.等，Nature449,851-861(2007)；GenomesProject,C.等，Nature467,1061-1073(2010)；和GenomesProject,C.等，Nature491,56-65(2012)),以及人种的进化史(Meyer等，Science338,222-226(2012))。最后，最近描述的基因表达中普遍的等位基因失衡(allelicimbalances)提示等位基因之间的遗传或表观遗传差异可能促成表达的定量差异(Gimelbrant等，Science318,1136-1140(2007)；Kong等，Nature462,868-874(2009)；Xie等，Cell148,816-831(2012)；和McDaniell等，Science328,235-239(2010))。因此，对单体型结构的理解对于描绘促成这些等位基因失衡的变体机制将是关键的。总的来说，个体中完全单体型结构的知识对于推进个体化医疗至关重要。认识到单体型的重要性，几个小组已经寻求扩展在群体和个体水平两者上对单体型结构的理解。诸如InternationalHapmap工程和1000基因组工程等倡导已经尝试着通过连锁不平衡测量(linkagedisequilibriummeasures)基于无关个体群体测序数据或通过家庭三人组(familytrios)的基因型分析(genotyping)系统性重构(reconstruct)单体型。然而，使用该方法产生的准确定相(phased)的单体型的平均长度被限制为约300kb(Fan等，NatureBiotechnology29,51-57(2011)和Browning等，AmericanJournalofHumanGenetics81,1084-1097(2007))。也开发了许多实验方法来促进对个体的单体型定相，包括LFR测序，配偶配对(mate-pair)测序，fosmid测序，以及基于稀释的测序(Levy等，PLoSBiology5,e254(2007)；Bansal等，Bioinformatics24,i153-159(2008)；Kitzman等，NatureBiotechnology29,59-63(2011)；Suk等，GenomeResearch21,1672-1685(2011)；Duitama等，NucleicAcidsResearch40,2041-2053(2012)；和Kaper等，ProcNatlAcadSciUSA110,5552-5557(2013))。这些方法最多可以重构范围在几千碱基到约百万碱基的单体型，但没有一个能够达到染色体跨度的单体型。使用基于荧光辅助细胞分选(FACS)的测序，染色体分离及随后的测序，以及基于染色体微切割(micro-dissection)的测序完成了全染色体单体型定相(Fan等，NatureBiotechnology29,51-57(2011)；Yang等，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica108,12-17(2011)；和Ma等，NatureMethods7,299-301(2010))。然而，这些方法是低分辨率的，因为它们只能对个体中一部分的杂合变体进行定相，更重要的是，它们的执行在技术上具有挑战性，或要求专业的仪器。最近，使用来自精子细胞的基因型分析，已经进行了全基因组单体型分析(Kirkness等，GenomeResearch23,826-832(2013))。虽然该方法可以以高分辨率产生基因组跨度的单体型，但它不适用于普通人群，并需要复杂的减数分裂重组模式的解卷积(deconvolution)。与全基因组单体型分析一起，靶向单体型分析(targetedhaplotyping)也是重要的。特别地，对HLA(人白细胞抗原)基因座的靶向单体型分析可以帮助用于器官移植的受体-供体匹配以及阐明顺式调节元件在基因活性中的作用。计算分析已经表明，来自先前建立的DNA鸟枪法测序方法的单体型重构中的重要因素是经测序本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于对生物体全染色体单体型分析的方法，包括：/n提供所述生物体的细胞，其含有具有基因组DNA的染色体组；/n将所述细胞或其核与固定试剂孵育一段时间以允许所述基因组DNA原位交联，并且从而形成交联的基因组DNA；/n片段化所述交联的基因组DNA，并连接临近定位的交联并片段化的基因组DNA以形成临近连接的复合物，所述复合物具有第一基因组DNA片段和第二基因组DNA片段；/n剪切所述临近连接的复合物以形成临近连接的DNA片段；/n获得多个所述临近连接的DNA片段以形成文库；/n对所述多个临近连接的DNA片段测序以获得多个序列读出；/n进行局部条件性定相；和/n组装所述多个序列读出以构建一个或多个染色体的染色体跨度的单体型，其中在片段化步骤前不纯化所述交联的基因组DNA，/n其中所述方法不是诊断方法。/n

【技术特征摘要】
20130719 US 61/856,486;20130904 US 61/873,6711.一种用于对生物体全染色体单体型分析的方法，包括：
提供所述生物体的细胞，其含有具有基因组DNA的染色体组；
将所述细胞或其核与固定试剂孵育一段时间以允许所述基因组DNA原位交联，并且从而形成交联的基因组DNA；
片段化所述交联的基因组DNA，并连接临近定位的交联并片段化的基因组DNA以形成临近连接的复合物，所述复合物具有第一基因组DNA片段和第二基因组DNA片段；
剪切所述临近连接的复合物以形成临近连接的DNA片段；
获得多个所述临近连接的DNA片段以形成文库；
对所述多个临近连接的DNA片段测序以获得多个序列读出；
进行局部条件性定相；和
组装所述多个序列读出以构建一个或多个染色体的染色体跨度的单体型，其中在片段化步骤前不纯化所述交联的基因组DNA，
其中所述方法不是诊断方法。


2.权利要求1的方法，其中所述局部条件性定相是邻域校正的定相。


3.权利要求1的方法，其中进行局部条件性定相的步骤使用群体规模测序数据。


4.一种用于生物体的靶向单体型分析的方法，包括：
提供所述生物体的细胞，其含有具有基因组DNA的染色体组；
将所述细胞或其核与固定试剂孵育一段时间以允许所述基因组DNA的原位交联，并且从而形成交联的基因组DNA；
片段化所述交联的基因组DNA，并连接临近定位的交联并片段化的DNA以形成临近连接的复合物，所述复合物具有第一基因组DNA片段和第二基因组DNA片段；
剪切所述临近连接的复合物以形成临近连接的DNA片段；
使所述临近连接的DNA片段与一个或多个寡核苷酸接触，所述寡核苷酸与所述临近连接的片段的子集的预选择区域杂交，以提供与所述寡核苷酸杂交的临近连接的片段的子集，将所述临近连接的片段的子集与所述寡核苷酸分离；
对所述临近连接的DNA片段的子集测序以获得多个序列读出；
进行局部条件性定相；和
组装所述多个序列读出以构建靶向单体型，其中在片段化步骤前不纯化所述交联的基因组DNA，
其中所述方法不是诊断方法。


5.权利要求4的方法，其中所述局部条件性定相是邻域校正的定相。


6.权利要求4的方法，其中进行局部条件性定相的步骤使用群体规模测序数据。


7.权利要求4的方法，其中所述寡核苷酸固定化到固体基质上。


8.权利要求1或4的方法，进一步包括在孵育步骤前从所述细胞分离细胞核。


9.权利要求1或4的方法，进一步包括在片段化步骤后，
使用标志物标记所述第一基因组DNA片段或所述第二基因组DNA片段；
连接所述第一基因组DNA片段和所述第二基因组DNA片段，使得所述标志物在它们之间以形成标记的嵌合DNA分子；和
剪切所述标记的嵌合DNA分子以形成标记的、临近连接的DNA片段。


10.权利要求1或4的方法，其中通过使用限制酶消化所述连接的基因组DNA以形成消化的基因组DNA片段进行所述片段化步骤。


11.权利要求1或4的方法，其中所述固定试剂包括甲醛，戊二醛，或福尔马林。


12.权利要求9的方法，其中通过使用标记有所述标志物的核苷酸填充所述第一或第二基因组DNA片段的末端进行所述标记步骤。


13.权利要求12的方法，其中所述标志物是生物素。


14.权利要求13的方法，其中使用链霉亲合素进行所述获得步骤。


15.权利要求14的方法，其中所述链霉亲合素固定到珠。


16.权利要求9的方法，其中通过使用连接酶连接所述第一基因组DNA片段和所述第二基因组DNA片段进行所述连接步骤。


17.权利要求16的方法，其中在溶液中进行所述连接。


18.权利要求16的方法，其中在固体基质上进行所述连接。


19.权利要求1或4的方法，其中使用配对末端测序片段的配对末端测序进行测序。


20.权利要求19的方法，其中每个配对末端测序读出片段的长度为至少20bp。


21.权利要求19的方法，其中每个配对末端测序读出片段的长度为20-150bp。


22.权利要求19的方法，其中每个配对末端测序读出片段的长度为20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150bp。


23.权利要求1或4的方法，其中对于每条染色体，所述文库含有至少15x序列覆盖。


24.权利要求23的方法，其中对...

【专利技术属性】
技术研发人员：B任，S塞尔瓦拉，J狄克逊，A施米特，
申请(专利权)人：路德维格癌症研究有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH