【技术实现步骤摘要】
一种检测双链断裂产生试剂活性的方法
本专利技术提供了一种同时检测双链断裂产生试剂,特别是工程核酸酶(engineerednuclease)的编辑效率和特异性的方法。
技术介绍
在基因工程中,常常需要合适的基因组编辑工具以实现对目标基因或者基因组片段的操作,而能够在目标基因组序列中造成双链断裂是各类基因组编辑工具工程的基本功能。其中一类应用广泛的双链断裂试剂就是工程核酸酶(engineerednuclease),其包括meganucelases、锌指核酸酶(zincfingernucleases)、类转录活化因子核酸酶(Transcriptionactivator-likeeffectornuclease,TALEN)以及CRISPR/Cas(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPR-associatedproteins)等,能够精确的在几乎任何基因组位置实现靶向编辑,从而实现了对基因组的精确修饰。在其中,源于细菌以及古细菌的免疫系统的CRISPR/Cas,能够利用靶位点特异性的RNA指引Cas蛋白对靶位点序列进行修饰,由于其高效率和简便性,近年来引起了广泛的关注,已成为一种新型高效的基因组编辑工具。然而,包括CRISPR/Cas在内的工程核酸酶均存在着脱靶活性,即在与靶位点有一定序列差异的其它基因组位置上造成切割,有时甚至会导致染色质重排,这大大增加了基因编辑带来的风险,从而极大限制了基因编辑手段在临床治疗上的应用。现有技术中已经开 ...
【技术保护点】
1.一种检测双链断裂(DSB)产生试剂的活性的方法,所述双链断裂产生试剂能够在基因组的目标位置处产生双链断裂,包括:/n(1)使所述试剂与样品接触以在其基因组中发生双链断裂(DSB)事件;/n(2)以步骤(1)经处理的基因组核酸为模板,利用与所述目标位置旁侧序列互补的延伸引物,进行延伸反应以获得序列延伸超过目标位置的延伸产物;/n(3)使所述延伸产物在延伸末端连接桥接接头,其中所述桥接接头包含一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)长度为n个核苷酸的随机核酸区段,其中n为1-30或更多,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30;使得每条延伸产物通过连接所述桥接接头获得由所述随机核酸区段赋予的独特身份标识(unique identifer);和/n(4)将步骤(3)所得延伸产物与桥接接头的连接产物进行高通量测序,识别是否在目标位置处发生双链断裂事件和/或在非目标位置处发生的双链断裂事件。/n
【技术特征摘要】
1.一种检测双链断裂(DSB)产生试剂的活性的方法,所述双链断裂产生试剂能够在基因组的目标位置处产生双链断裂,包括:
(1)使所述试剂与样品接触以在其基因组中发生双链断裂(DSB)事件;
(2)以步骤(1)经处理的基因组核酸为模板,利用与所述目标位置旁侧序列互补的延伸引物,进行延伸反应以获得序列延伸超过目标位置的延伸产物;
(3)使所述延伸产物在延伸末端连接桥接接头,其中所述桥接接头包含一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)长度为n个核苷酸的随机核酸区段,其中n为1-30或更多,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30;使得每条延伸产物通过连接所述桥接接头获得由所述随机核酸区段赋予的独特身份标识(uniqueidentifer);和
(4)将步骤(3)所得延伸产物与桥接接头的连接产物进行高通量测序,识别是否在目标位置处发生双链断裂事件和/或在非目标位置处发生的双链断裂事件。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述试剂包括工程核酸酶(engineerednuclease),例如所述试剂是锌指核酸酶(ZFN)、TALEN或者CRISPR-CAS。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述样品是真核细胞,例如动物细胞(优选哺乳动物细胞)或植物细胞,或者原核细胞。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中步骤(2)中,在发生延伸反应之前,延伸引物与样品基因组进行一次或更多次变性-退火循环,优选进行1次-20次,例如1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次或20次。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述延伸引物带有亲和标签(affinitytag),例如在延伸引物5’端连接有亲和标签,例如生物素(biotin)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法,其中在步骤(1)后,还包括对基因组进行片段化的步骤,例如超声处理或者内切酶消化。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其中所述步骤(2)中,所述延伸引物与基因组核酸的结合位点位于目标位置的双链断裂上游或下游2kb以内,例如1kb、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp或100bp以内。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法,其中在步骤(2)获得延伸产物后,还包括分离延伸产物的步骤;优选的,所述分离是利用延伸引物的亲和标签通过亲和纯化进行的;更优选的,所述亲和纯化基于生物素与亲和素或链霉亲和素之间的结合,进一步优选的,所述亲和素或链霉亲和素连接于固体基质上,例如珠子(bead)。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法,其中所述活性是指所述试剂的切割效率和/或特异性;或者,在所述测序后还包括根据测序结果分析所述试剂的切割效率和/或特异性的步骤。
10.一种筛选基因组双链断裂位点的方法,其包括
(1)分析目标基因组序列获得双链断裂候选靶位点;
(2)利用双链断裂产生试剂在步骤(1)中的候选靶位点处制造双链断裂;
(3)进行权利要求1至9中任一项所述的步骤;和
(4)分析不同候选靶位点处所述试剂的切割效...
【专利技术属性】
技术研发人员:胡家志,尹健行,刘孟竺,刘阳,
申请(专利权)人:北京大学,
类型:发明
国别省市:北京;11
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