一种基于高通量测序技术用于线粒体高变区复合扩增的引物组合、测序方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种基于高通量测序技术用于线粒体高变区复合扩增的引物组合、测序方法及其应用，涉及高通量测序技术领域。所述引物组合包括5对引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10所示。本发明专利技术还提供了用于线粒体高变区的高通量基因测序的方法，所述方法包括利用SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10所示引物组合构建测序文库；采用高通量测序的方法对所述测序文库进行检测。本发明专利技术提供的用于线粒体高变区复合扩增的引物组合以及测序方法能够同时检测多个样本的线粒体高变区基因，有效提高检测效率、准确率、灵敏度，同时降低了成本、简化了操作步骤，通过单管反应即可获得检测结果。

【技术实现步骤摘要】
一种基于高通量测序技术用于线粒体高变区复合扩增的引物组合、测序方法及其应用
本专利技术涉及高通量测序
，尤其是涉及一种基于高通量测序技术用于线粒体高变区复合扩增的引物组合、测序方法及其应用。
技术介绍
线粒体DNA(mtDNA)作为一种独立存在的遗传物质，其高突变率是造成其遗传多样性的重要原因，不仅是个体身份识别不可或缺的技术手段，也是研究母系群体进化迁移的生物学工具。人类mtDNA为环状双链结构，长16569bp，线粒体DNA的非编码区(也称为控制区)，控制区的碱基变异相对集中分布在15996-16401和29-408区段，分别称为HV1和HV2，后有研究者发现438-574之间也存在较多的碱基变异，称为HV3。当在单个个体中存在不止一种类型的mtDNA(即出现两种或两种以上的碱基序列)时，这种现象称mtDNA的异质性。检测不同水平的mtDNA异质性，需要依靠具有不同灵敏度的不同检测方法。DNASanger测序目前仍是金标准，但是只能检测出mtDNA异质性大于10-15％或10-20％以上的位点。时相温度梯度凝胶电泳(temporaltemperaturegradientgelelectrophoresis，TTGE)可以检测到突变频率为4％的mtDNA异质性位点。变性高效液相色谱(Denaturinghighperformanceliquidchromatography，DHPLC)是一种高通量的基因突变检测技术，可以检测到突变频率为1％的mtDNA异质性位点，因此DHPLC技术在个体身份识别领域应用比较广泛。随着测序技术的发展，高通量测序技术由于其高覆盖度、高灵敏度及低成本等优势倍受研究人员青睐，也逐步应用于mtDNA异质性研究，但是目前还没有形成统一标准，使用不同的仪器、化学试剂以及不同的异质性评判标准，各实验室之间的检测结果也会有很大的差异。由于mtDNA异质性在疾病、个体身份识别、亲子鉴定和犯罪嫌疑人认定等方面均有重要意义，因此提高mtDNA异质性检测的灵敏度就尤为必要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于高通量测序技术用于线粒体高变区复合扩增的引物组合、测序方法及其应用，本专利技术提供的用于线粒体高变区复合扩增的引物组合以及测序方法剂能够同时检测多个样本的线粒体高变区基因，有效提高检测效率、准确率、灵敏度。本专利技术是通过以下技术方案实现的：在一方面，本专利技术提供了一种基于高通量测序技术用于线粒体高变区复合扩增的引物组合，所述引物组合包括5对引物，所述引物的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2；SEQIDNO.3和SEQIDNO.4；SEQIDNO.5和SEQIDNO.6；SEQIDNO.7和SEQIDNO.8；以及SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示。在另一方面，本专利技术提供了一种用于线粒体高变区的高通量基因测序的方法，所述方法包括利用本专利技术所述引物组合构建测序文库；采用高通量测序的方法对所述测序文库进行检测。在一个实施方案中，利用本专利技术所述引物组合构建测序文库包括：(a)利用本专利技术所述引物组合对不同样本的线粒体高变区基因进行PCR扩增，得到第一扩增产物；(b)以第一扩增产物为模板进行接头序列PCR扩增反应及产物纯化，得到包含所述线粒体高变区基因的测序文库。在一个实施方案中，在步骤(a)中，在PCR扩增体系中，引物按终浓度不同分为三组，A组：SEQIDNO.5～6和SEQIDNO.8所示序列的引物，B组：SEQIDNO.7所示序列的引物，C组：SEQIDNO.1～SEQIDNO.4和SEQIDNO.9～SEQIDNO.10所示序列的引物；三组引物终浓度的比例A组：B组：C组为2：4：1，优选地，三组引物终浓度A组：B组：C组分别为0.2μM：0.4μM：0.1μM。在本申请的PCR扩增体系中，针对三组多重引物使用不同的终浓度同时进行扩增，优化了扩增体系，避免引物之间的相互干扰，提高扩增出的序列的含量，使扩增产物产量尽量趋于均衡。在一个实施方案中，在所述步骤(a)和所述步骤(b)之间还包括纯化的步骤，优选进行磁珠纯化，更优选经AMPureXP磁珠纯化。在一个实施方案中，在所述步骤(b)中，在将已纯化PCR产物进行末端修复、将修复末段连接接头和连接有接头的产物磁珠纯化后，再进行接头序列PCR扩增。在一个实施方案中，在所述步骤(b)中，所述接头序列PCR扩增过程中使用i7引物以及i5引物进行扩增，所i7引物以及i5引物的序列分别如SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示。在一个实施方案中，在得到包含所述线粒体高变区基因的测序文库之后，进行文库定量、高通量检测和数据分析；优选地，高通量测序采用MiSeqFGx测序；优选地，所述数据分析为采用NextGENe软件分析突变位点、变异频率、突变类型和/或覆盖深度。在一个实施方案中，本专利技术提供了一种基于高通量测序测序技术用于mtDNA异质性检测的方法，所述方法包括通过上述用于线粒体高变区的高通量基因测序的方法获得数据分析结果，根据数据比对分析确定高通量测序样本的单倍型，然后进行mtDNA异质性分析。在另一方面，本专利技术还提供了所述引物组合在构建用于检测线粒体高变区基因变异的高通量测序文库中的应用。本申请设计的引物，经过了筛选和实验验证，引物扩增产物长度在290-320bp之间，各个引物的扩增效率及特异性良好。非特异性扩增比例较低，适用于高通量测序。本专利技术提供的用于线粒体高变区复合扩增的引物组合适用于同时检测多个样本的线粒体高变区基因，通过引物设计，实现对于三个高变区的交叉覆盖，一次性检测三个高变区相关的基因，检测位点多。本专利技术提供的测序方法在一个反应管里完成建库，能够提高高通量测序的样本通量，不需要像Sanger测序那样做多次反应，有效降低超高通量测序成本，并且有效提高检测效率、准确率、灵敏度，同时降低了成本、简化了操作步骤，通过单管反应即可获得检测结果。本专利技术测序操作灵活、简单、快速，本专利技术的方法对于检测mtDNA的突变位点、变异频率、突变类型和/或覆盖深度等方面具有优势，可应用于通过单克隆样本单倍型的唯一性分析mtDNA异质性，可辅助用于提高个体身份识别、亲子鉴定和犯罪嫌疑人认定的鉴定效力。本专利技术采用高通量测序技术的灵敏性结合数字PCR绝对定量技术的准确性以及单克隆样本单倍型的唯一性建立一种mtDNA异质性检测的方法，可以对线粒体高变区单倍型进行测定，进行异质性分析，还可以获得更多遗传变异信息。本专利技术的通量测序分析符合mtDNA异质性阈值为1％时的最低覆盖度大于4000×。分析高通量测序技术对mtDNA异质性检测的灵敏度，提高个体身份识别、亲子鉴定和犯罪嫌疑人认定的鉴定效力。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于高通量测序技术用于线粒体高变区复合扩增的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括5对引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；以及SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于高通量测序技术用于线粒体高变区复合扩增的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括5对引物，所述引物的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2；SEQIDNO.3和SEQIDNO.4；SEQIDNO.5和SEQIDNO.6；SEQIDNO.7和SEQIDNO.8；以及SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示。


2.一种用于线粒体高变区的高通量基因测序的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1所述的引物组合构建测序文库；采用高通量测序的方法对所述测序文库进行检测。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述利用权利要求1所述的引物组合构建测序文库包括：
(a)利用权利要求1所述的引物组合对不同样本的线粒体高变区基因进行PCR扩增，得到第一扩增产物；
(b)以第一扩增产物为模板进行接头序列PCR扩增反应及产物纯化，得到包含所述线粒体高变区基因的测序文库。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，在PCR扩增体系中，引物按终浓度不同分为三组，
A组：SEQIDNO.5～SEQIDNO.6和SEQIDNO.8所示序列的引物，
B组：SEQIDNO.7所示序列的引物，
C组：SEQIDNO.1～SEQIDNO.4和SEQIDNO.9～SEQIDNO.10所示序列的引物；
三组引物终浓度的比例A组：B组：C组为2：4：1，优选地，三组引...

【专利技术属性】
技术研发人员：王升启，唐召兵，张庆珍，周喆，刘丽艳，刘琪琦，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11