一种基于环境DNA的过鱼通道效果监测和评估方法技术

本发明专利技术公开了一种基于环境DNA的过鱼通道效果监测和评估方法，包括如下步骤：S1、在过鱼通道的入口、出口和休息池设置3个采样点，采集水样并保存；S2、将采集的水样进行抽滤，然后提取总的环境DNA；S3、以提取的总的环境DNA为模板，利用设计的引物进行PCR扩增16S rDNA序列，获得PCR产物；S4、将PCR产物回收、纯化，进行高通量测序，获得PCR产物序列；S5、建立鱼类16S rDNA序列比对数据库；S6、通过BLAST在NCBI数据库和已构建的数据库查找同源序列，确定鱼类物种信息；S7、统计所获得的鱼类物种信息，完成过鱼通道效果的监测和评估，与其他现有方法相比，无需进行大量的捕捞作业或仪器的操作，采样简单，而且不会对鱼类造成伤害，有利于鱼类的保护。

【技术实现步骤摘要】
一种基于环境DNA的过鱼通道效果监测和评估方法
本专利技术涉及分子生态学
，具体为一种基于环境DNA的过鱼通道效果监测和评估方法。
技术介绍
过鱼通道是供鱼类通过拦河水闸或坝的人工设施，由于水利工程的修建破坏了河流的连通性，阻碍了河流中鱼类的洄游和物质的传输，严重威胁鱼类的生物多样性，为了缓解水利工程造成的负面影响，一般通过在水闸或坝上修建过鱼通道来保护鱼类的自然生活习性，实现上下游鱼类洄游和种群的交流；过鱼通道效果监测和评估的研究起步较晚，对于效果的监测和评估没有统一的标准；虽然相关研究已有报道，但世界范围内数以万计的过鱼通道，绝大多数都未被监测和评估，过鱼通道效果监测和评估通常采用的方法有张网法、堵截法、视频监测、水声学和遥感法等，但这些方法也存在弊端，比如对鱼类造成损伤、消耗时间长、仪器设备使用成本高、不便于操作；环境DNA(environmentalDNA,eDNA)在20世纪80年代就被提出，初期仅应用于微生物研究，是指环境样品中，例如土壤、空气、水体、沉积物等，有机体脱落释放的DNA，随着分子生物学技术的发展，可以利用环境中包含的DNA进行物种的鉴定，近年来，eDNA技术被应用于水环境中来确定物种是否存在。
技术实现思路
本专利技术提供一种基于环境DNA的过鱼通道效果监测和评估方法，可以有效解决上述
技术介绍
中提出过鱼通道效果监测和评估的研究起步较晚，对于效果的监测和评估没有统一的标准；虽然相关研究已有报道，但世界范围内数以万计的过鱼通道，绝大多数都未被监测和评估，过鱼通道效果监测和评估通常采用的方法有张网法、堵截法、视频监测、水声学和遥感法等，但这些方法也存在弊端，比如对鱼类造成损伤、消耗时间长、仪器设备使用成本高、不便于操作的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种基于环境DNA的过鱼通道效果监测和评估方法，包括如下步骤：S1、在过鱼通道的入口、出口和休息池设置3个采样点，采集水样并保存；S2、将采集的水样进行抽滤，然后提取总的环境DNA；S3、以提取的总的环境DNA为模板，利用设计的引物进行PCR扩增16SrDNA序列，获得PCR产物；S4、将PCR产物回收、纯化，进行高通量测序，获得PCR产物序列；S5、建立鱼类16SrDNA序列比对数据库；S6、通过BLAST在NCBI数据库和已构建的数据库查找同源序列，确定鱼类物种信息；S7、统计所获得的鱼类物种信息，完成过鱼通道效果的监测和评估。根据上述技术方案，所述S1中采集水样分别在表层、中层和下层各采集3次水样，每次采集2L水样，样品保存要置于4℃冷藏，并在24h内进行抽滤处理。根据上述技术方案，所述S2中水样抽滤使用的滤膜规格为0.45μm孔径的硝酸纤维素无菌过滤膜，样品抽滤后直接提取DNA或者置于-20℃保存，总的环境DNA的提取采用氯仿萃取法提取或使用DNA提取试剂盒。根据上述技术方案，所述S3中各采样点采集的表层、中层和下层水样抽滤后混合作为该采样点样本进行总环境DNA提取。根据上述技术方案，所述S3中PCR扩增使用的引物为：正向引物F：5-GCCTGTTTACCAAAAACATCAC-3；反向引物R：5-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3；目标片段长度为546bp。根据上述技术方案，所述S3中PCR扩增使用25μL反应体系：2.5μL10×buffer，2μLdNTP，各1μL正反引物，0.15μLTaq酶，1μLDNA模板，17.35μLddH2O；反应条件设置为：94℃预变性2min；94℃变性30s，50℃退火40s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。根据上述技术方案，所述S5中根据过鱼通道所在水域的鱼类历史调查资料和文献资料，掌握水域鱼类种类信息；在NCBI数据库查询搜集鱼类16SrDNA序列，并用权利要求4所述引物PCR扩增，补充未查询到的序列，构建序列比对数据库。与现有技术相比，本专利技术的有益效果：本专利技术结构科学合理，使用安全方便，本专利技术将环境DNA的技术原理应用在过鱼通道效果监测和评估工作中，提供了一种基于环境DNA的过鱼通道效果监测和评估方法；实施上述技术方案的益处为：1、与其他现有方法相比，无需进行大量的捕捞作业或仪器的操作，采样简单，而且不会对鱼类造成伤害，有利于鱼类的保护；2、利用环境DNA技术使样本的采集和鱼类种类的鉴定更加简单、高效、快速，而且检测结果可靠、使用成本低；3、由于本方法有以上优点，该方法可用于长期的监测工作，可对大量的过鱼通道建立监测网。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1是本专利技术的实施流程示意图；图2是本专利技术的采样点示意图。具体实施方式以下结合附图对本专利技术的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例：如图1-2所示，本专利技术提供技术方案，一种基于环境DNA的过鱼通道效果监测和评估方法，包括以下步骤：S1、水样的采集和环境DNA的提取：在连江西牛过鱼通道的入口、出口和休息池设置采样点进行水样的采集，分别在表层、中层和下层各采集3次，每次采集2L水样，每个点9个样品，总共27个样品；将采集的样品放置于4℃冷藏箱保存，在24h内对水样进行抽滤处理，抽滤处理使用的滤膜规格为0.45μm孔径的硝酸纤维素无菌过滤膜；将每个采样点的9个抽滤样品分别混合进行DNA的提取，使用DNA提取试剂盒提取各采样点滤膜中的DNA，提取后使用TE缓冲液溶解，放置-20℃保存备用。S2、PCR扩增和高通量测序：采用引物(正向引物F：5-GCCTGTTTACCAAAAACATCAC-3；反向引物R：5-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3)PCR扩增16SrDNA序列，PCR扩增使用25μL反应体系：2.5μL10×buffer，2μLdNTP，各1μL正反引物，0.15μLTaq酶，1μLDNA模板，17.35μLddH2O；反应条件设置为：94℃预变性2min；94℃变性30s，50℃退火40s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min；PCR扩增结果使用琼脂糖凝胶电泳进行检测并回收、纯化；将纯化的PCR样品送至生物公司利用第二代高通量测序技术进行测序，获得PCR序列信息。S3、建立鱼类16SrDNA序列比对数据库：根据连江鱼类相关文献资料信息和调查数据，掌握连江鱼类种类名录，在NCBI数据库中查询搜集相关鱼类的16SrDNA序列，并利用第二步骤的方法测序，补充未查询到的鱼类16SrDNA序列信息，构建连江鱼类16SrDNA序列比对数据库本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于环境DNA的过鱼通道效果监测和评估方法，其特征在于：包括如下步骤：/nS1、在过鱼通道的入口、出口和休息池设置3个采样点，采集水样并保存；/nS2、将采集的水样进行抽滤，然后提取总的环境DNA；/nS3、以提取的总的环境DNA为模板，利用设计的引物进行PCR扩增16S rDNA序列，获得PCR产物；/nS4、将PCR产物回收、纯化，进行高通量测序，获得PCR产物序列；/nS5、建立鱼类16S rDNA序列比对数据库；/nS6、通过BLAST在NCBI数据库和已构建的数据库查找同源序列，确定鱼类物种信息；/nS7、统计所获得的鱼类物种信息，完成过鱼通道效果的监测和评估。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于环境DNA的过鱼通道效果监测和评估方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、在过鱼通道的入口、出口和休息池设置3个采样点，采集水样并保存；
S2、将采集的水样进行抽滤，然后提取总的环境DNA；
S3、以提取的总的环境DNA为模板，利用设计的引物进行PCR扩增16SrDNA序列，获得PCR产物；
S4、将PCR产物回收、纯化，进行高通量测序，获得PCR产物序列；
S5、建立鱼类16SrDNA序列比对数据库；
S6、通过BLAST在NCBI数据库和已构建的数据库查找同源序列，确定鱼类物种信息；
S7、统计所获得的鱼类物种信息，完成过鱼通道效果的监测和评估。


2.根据权利要求1所述的一种基于环境DNA的过鱼通道效果监测和评估方法，其特征在于，所述S1中采集水样分别在表层、中层和下层各采集3次水样，每次采集2L水样，样品保存要置于4℃冷藏，并在24h内进行抽滤处理。


3.根据权利要求1所述的一种基于环境DNA的过鱼通道效果监测和评估方法，其特征在于，所述S2中水样抽滤使用的滤膜规格为0.45μm孔径的硝酸纤维素无菌过滤膜，样品抽滤后直接提取DNA或者置于-20℃保存，总的环境DNA的提取采用氯仿萃取法提取或使用DNA提取试剂盒。


4.根据权利要求1所述的一种基于环境DNA的过鱼...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱书礼，李新辉，李捷，李跃飞，陈蔚涛，杨计平，武智，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44