膜联蛋白A2的血清检测方法、检测试剂盒及其应用技术

本发明专利技术涉及Ａｎｎｅｘｉｎ　　Ａ２的血清检测方法、检测试剂盒及其应用，具体而言，涉及单独使用新的标志物Ａｎｎｅｘｉｎ　　Ａ２检测ＨＣＣ或者与ＡＦＰ联用使用检测ＨＣＣ的方法、检测试剂盒及其应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物学领域，具体而言，涉及单独使用新的标志物检 测HCC或者与AFP联用使用检测HCC的方法、检测试剂盒及其应用.
技术介绍
肝癌(Liver cancer )是一种严重危害人类健康的恶性肺瘤，2000 年全世界新发病例约564， 000人，在所有恶性肿瘤中排第五位。由于 其恶性程度髙、预后不良，五年生存率不足10%。中国是肝癌的高发 区，集中了全世界约54%的新发病例，其中肝细胞肝癌 (hepatocellular carcinomas, HCC)占原发性肝癌的90 %以上。 据1991-2000年间，中国169， 871人口的死因抽样调查显示，它的死 亡率排在全部恶性肿瘤的第2位，年死亡率为54.7/100, 000 (男81.2， 女29.0)。甲胎蛋白(alpha-fetoprotein， AFP )是目前临床上公认的HCC 诊断标志物。20世纪5Q年代，Bergstrand等人首次在人类胎儿血清 中发现了这种电泳迁移率相当于甲种球蛋白的蛋白质，在正常成人血 清中并没有检测到它的存在。 1960年，AbelevG及其同事在小鼠的 肝细胞癌中发现了这种甲种球蛋白，它不存在于正常小鼠的任何组织 中，经证实它是胎鼠血清中的主要成分，在成年鼠肝细胞再生时会重 新出现。因此，人们将这种主要存在于胎儿组织的蛋白命 名为甲胎蛋白。目前已知，AFP是一种分泌型糖蛋白，与白蛋白同属于白蛋白样 基因家族。它主要存在于啮齿类动物和人胚胎期血清中，由胚胎发育 时期卵黄囊内胚层和胎肝合成并分泌到血液中。在人类胚胎中AFP最高浓度可达3-4mg/ml,出生后，血清中AFP浓度迅速下降，新生儿期 约为10-50 ng/ml，正常成人一般在10ng/ml以下。怀孕期间母体血 清中AFP浓度的变化可以提示多种胚胎发育缺陷8]。而成人中，升高 的血清AFP水平不仅存在于60%-70%的HCC病人，也可见于大约20 %的慢性肝炎，20%-60%的肝炎肝硬化和某些胚胎性癌患者。在有 慢性肝炎和肝硬化背景的HCC患者中，AFP的诊断价值更低。因 此，AFP对于HCC患者的诊断灵敏度介于41%-97%之间，特异度在 80%-95%，而阳性预测值徘徊在9%-58%之间[1°—12。更为重要的是， 临床上有20%-30%的HCC患者血清AFP水平并不升高，从而大大限制 了其在HCC临床检查中的应用价值。因此，目前迫切需要找到能与AFP 联合使用，提高HCC诊断准确度的新标志物。综上所述，由于目前尚缺乏有效的肝癌检测方法，因此，本领域 迫切需要开发建立新的肝癌患者血清ELISA检测方法和可以方便快捷 检测的试剂盒。为此，本专利技术人进行了大量的研发工作，在前期工作中，专利技术人 提取了三个肝癌细胞系HepG2、 Hep3B和SK-HEP-1，及一个正常肝细 胞系HL-7702的亚细胞组分，并经双向电泳分离(2-DE)，选取具有 三倍以上差异的蛋白质点，胶内酶解后经MALDI-TOF-TOF质i脊鉴定。 在胞浆组分中，专利技术人意外地发现了一个在AFP阴性肝癌细胞系 SK-HEP-1中特异性高表达的蛋白质点，经质谱鉴定为膜联蛋白2 (Annexin A2， ANXA2 )。ANXA2属于annexins蛋白家族成员，是一种Ca2+离子结合蛋白， 其C端核心结构域包含磷脂、F-actin和肝素的结合位点，而N端包 含PKC (Ser-25)和Src (Tyr-23)的磷酸化调节位点"3-15。ANXA2在 细胞内以三种形式存在单体、二聚体和四聚体。二聚体由一分子的 ANXA2和一分子的3-磷酸甘油酸激酶组成。四聚体由两分子的ANXA2 和两分子的SIOOAIO (P11)组成。四聚体对单体的相对量随着细胞或 组织的类型而不同，小肠上皮细胞中ANXA2的四聚体大约是100%, 而培养的成纤维细胞中单体形式的ANXA2占了 50%以上。目前认为，ANXA2可以中介细胞的胞泌、胞吞、actin依赖的嚢泡转运、胞饮等过 程，调节离子通道并影响细胞骨架重建、细胞间黏附和运动，而且， 其在造血干细胞归巢、植入和维持骨髓微环境中发挥重要作用fl6-w。 在各种转化细胞中，如v-src、 v-H-ras、 v-mos和SV40转化细胞等， ANXA2的表达均会被诱导。而且，其基因表达受多种生长因子，如胰 岛素、IGF和EGF的调节。在多种人类肿瘤中如胰腺癌、高分化胶质 瘤、胃癌、肾细胞癌、肺癌、HCC和急性早幼粒细胞白血病中ANXA2 均表达上调，但在前列腺癌中表达下调(35—421。因此表明，ANXA2的上 调与细胞转化过程相关。另外，大约10%-15%的细胞内ANXA2与细胞 核相关。ANXA2可以与DM序列结合，是刺激DNA聚合酶a活性的引 物识别复合物的组成成分。在乳腺癌和头颈 部肿瘤中的研究结果发现，ANXA2是潜在的纤溶酶原和组织型纤溶酶 原激活蛋白(t-PA)受体，可能参与肿瘤侵袭和转移过程49'5°]。Dreier R等人曾利用免疫组织化学染色研究了 Annexin蛋白家族 成员在人体各个正常器官、组织中的表达情况，发现肝脏内的肝细胞 和Kupffer细胞均不表达Annexin A2f51]。 Tucker CJ等人在动物模型 中研究了砷酸诱发的HCC与对照正常肝脏之间的差异表达基因谱，其 中鉴定到的一个差异表达基因就是Annexin A2，其在肿瘤组织中明显 上调，real time PCR结果发现，在正常对照成年雄性C3H小鼠中， ANXA2的表达水平为1.0 ±0,3,在诱发HCC的小鼠癌旁正常组织和肿 瘤组织中Annexin A2的表达水平升高9倍和49倍(52。Lim S0等人利 用2-DE-MAILDI-T0F技术策略对比了正常、肝硬化和肝细胞肝癌组织 蛋白表达谱的差异，鉴定到的差异蛋白之一就是Annexin A2，该蛋白 在正常和肝硬化组织中的表达水平明显低于HCC肿瘤组织加。但是， 这两篇研究仅仅从基因组和蛋白质组的角度筛查了 HCC与健康肝脏之 间的表达差异，并没有在临床样品上对Annexin A2进行任何验证，而且，目前没有任何Annexin A2可以在人类血清中检测到，并与人类疾 病相关的报道。
技术实现思路
鉴于ANXA2在肿瘤发生发展中的重要作用，专利技术人对其在肝癌组 织中的表达情况进行了大样本量的验证分析，结果显示，在19例配对 肝癌组织的Western blot结果中，ANXA2在肿瘤组织中的表达上调率 为68.4 (13/19),而40例配对HCC组织的免疫组织化学染色结果表 明，其在胂瘤组织中的表达阳性率为60% ( 24/40 )，而在癌旁正常 组织中的表达阳性率仅为10%,经过Chi-square检验证明，ANXA2 是一种在肝癌组织中高表达的蛋白质(p<0. 0001 )。因此，专利技术人认 为ANXA2蛋白的表达与肝癌具有十分重要的联系，可以作为肝癌相对 特异性的敏感标志蛋白。虽然ANXA2不具有信号肽，但是，文献报道， 它存在于外体(exosome)中，我们推测，它可以经非经典分泌途径分 泌入血(5"5]，在肝癌患者血清/血浆中可检测到，并作为肝癌早期血清 学检测的特异性标志物。在上述发现的基本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测待测生物样品中的Ａｎｎｅｘｉｎ　　Ａ２水平是否异常，进而获得作为中间结果的信息的方法，所述方法包括步骤：　　　　１）测定待检生物样品中的Ａｎｎｅｘｉｎ　　Ａ２水平；　　　　２）比较待检生物样品中的Ａｎｎｅｘｉｎ　　Ａ２水平和正常生物样品对照的Ａｎｎｅｘｉｎ　　Ａ２水平；　　　　３）获得作为中间结果的信息，　　　　４）根据比较结果确定待检生物样品是否有可能是ＨＣＣ样品。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵晓航，孙玉琳，乔媛媛，
申请(专利权)人：中国医学科学院肿瘤研究所，中国人民解放军海军总医院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]