一种利用毕赤酵母生产皮蝇素C的方法技术

本发明专利技术公开一种利用毕赤酵母生产皮蝇素Ｃ的方法，包括如下步骤：首先用ＰＣＲ扩增ＨＣ基因，酶切重组载体和片段ＨＣ，用连接酶连接后形成含有ＨＣ的重组质粒，将重组产物转入大肠杆菌，然后将含有ＨＣ的重组质粒酶切，线性化后通过电击转化入制备好的酵母感受态细胞中进行培养，筛选出多拷贝质粒菌株，对筛选出的细胞进行培养，离心收集细胞，进行诱导表达，最后将收集的上清液浓缩后，于缓冲液中透析、过滤，用阴离子交换层析柱纯化透析蛋白，收集含目的蛋白的洗脱液。本发明专利技术是一种低廉且产量高的表达ＨＣ的方法，毕赤酵母具有原核表达系统快速、简单、低廉的优点，其最大的优点是它自身分泌的蛋白很少，有利于纯化。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其涉及皮蝇素c，具体的是一种利用 毕赤酵母生产皮蝇素c的方法。
技术介绍
皮蝇蛆病 (//;^0&，^&)是由双翅目、皮蝇科、皮蝇属的牛皮蝇 (7fy/wcferm 6ov&)和纹皮蝇(/fy/wcferm //"eWwm)的幼虫寄生于牛的背 部皮下组织引起的人畜共患寄生虫病，该病给畜牧业造成严重经济损 失，在欧洲、北美、亚洲等地广泛流行，在我国甘肃、西藏、新疆、青 海、内蒙古等五大牧区流行甚为严重。皮蝇主要寄生在牛科、鹿科和麝 科动物体内。每年皮蝇蛆病都给畜牧业和皮革业生产带来了巨大的经济 损失。对于皮蝇蛆病的诊断除了临床诊断以外最常用的就是ELISA，包被 抗原采用的是皮蝇一期幼虫的可溶性抗原，这种抗原的主要成分是皮蝇 素A、 B和C， ELISA方法中主要针对的就是皮蝇素C的抗体。皮蝇素C 只在一期幼虫中表达，能在牛背上形成瘤包的二期和三期幼虫不表达， 有很高的抗原性和特异性。用HC做抗原、以ELISA为基础的免疫学诊 断方法对评价欧洲皮蝇蛆病的流行情况及检测包括法国、希腊、摩洛哥、 波兰、葡萄牙、西班牙和英国等在内的许多国家对该病的控制是具有重 要意义的。随着皮蝇蛆病控制工作的开展，获得天然可溶性抗原越来越困难， 评价皮蝇蛆病的感染和复发越来越困难。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用毕赤酵母生产皮蝇素C的方法，所述的方法要解决现有技术中的皮蝇素C难以获得的技术问题。本专利技术一种利用毕赤酵母生产皮蝇素C的方法，包括如下步骤(1) 根据皮蝇素C基因全长cDNA序列，设计含EcoR I和Not I酶切 位点的特异性引物，用PCR扩增出如SEQ ID N0:1所示HC基因，用 EcoR I和Not I分别酶切重组载体和片段HC，并用连接酶将其连接， 形成含有HC的重组质粒，将重组产物转入大肠杆菌，酶切、PCR鉴定、 测序确认；(2) 将含有HC的重组质粒以Sal I进行酶切，线性化后的重组质粒通 过电击转化入制备好的酵母感受态细胞中进行培养，筛选出多拷贝质粒 菌株；(3) 对筛选出的细胞进行培养，待菌液OD600值达2_6时离心收集 细胞，然后进行诱导表达；(4) 将收集的上清液浓縮后，于缓冲液中透析、过滤，用阴离子交换 层析柱纯化透析蛋白，收集含目的蛋白的洗脱液。进一步的，所述的重组载体pPIC9k。 进一步的，所述的酵母感受态细胞GS115。进一步的，在步骤3中采用BMGY培养基对筛选出的GS115细胞进 行培养。进一步的，在步骤3中，用含1.0%甲醇的BMMY培养基在3(TC对 GS115细胞进行诱导表达，每天添加甲醇至1.0%，甘油至O. 25%， 60小 时后收集上清。进一步的，在步骤4中，将收集的上清液浓縮后，于缓冲液中透析， 2—5小时换液一次，透析过液，滤膜过滤，然后用阴离子交换层析柱纯 化透析蛋白，收集含目的蛋白的洗脱液。进一步的，在用阴离子交换层析柱纯化透析蛋白的过程中，洗脱程序为5CV洗脱液洗脱杂蛋白，进样量2ml，梯度洗脱采取7XB液洗 杂蛋白，17XB液洗脱目的蛋白，流速1.0ml/min.， 280nmUV检测。进一步的，阴离子交换层析柱采用MonoQHR5/5。本专利技术的目的还在于提供皮蝇素C在制备用于皮蝇蛆病的免疫诊 断的药物或者试剂中的应用。本专利技术的目的还在于提供一种含有如SEQIDNO: 2所示的序列的 毕赤酵母表达载体pPIC9k- HC。本专利技术的目的还在于提供一种含有如SEQIDNO: 2所示的序列的 毕赤酵母毕赤酵母菌株GS115/pPIC9k- HC。本专利技术由于HC基因是插入到毕赤酵母基因组DNA中去得，所以 能够在高密度连续培养的情况下稳定表达。酵母表达所使用的培养基由 酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖、甘油等低廉原料组成，成本低。60 h为 一个培养周期，每升可获得约121mg蛋白。阴离子交换层析分离纯化 HC蛋白操作简单，易用推广应用。本专利技术和已有技术相比，利用毕赤酵母表达皮蝇素C，并用阴离子 交换层析柱分离纯化HC。这是一种低廉且高产的表达HC的方法，为 产业化生产奠定了基础。并且毕赤酵母可快速利用培养基中的碳源，稳 定复制基因组中的DNA，采用高密度连续培养，蛋白产量高，它除含 有真核表达系统共有的翻译后修饰功能等优点外，同时也具有原核表达 系统操作简单、成本低廉等优点。 附图说明图l为本专利技术pPIC9k-HC构建示意图。图2为本专利技术重组PCR和酶切鉴定图(其中M为3000bp DNA marker, 1为pPIC9k-HC经EcoR I和Not I酶切产物，2为PCR重组 质粒pPIC9k-HC扩增产物，3为PCR阴性对照)。图3为本专利技术细胞培养上清液SDS — PAGE电泳图(M为蛋白 Maker, 1-4为经TCA浓縮后重组菌上清，5为空载体阴性对照，6为法 国农科院馈赠的HC阳性对照)。图4为本专利技术纯化后皮蝇素C SDS-PAGE电泳图(1为纯化后的HC， 2为纯化前HC细胞培养上清液，M为蛋白Marker)。图5为本专利技术纯化蛋白Western-blot图(M为蛋白Maker, 1为 HC阳性对照，2，4为空载体阴性对照，3为重组菌表达上清5为纯化 的HC)。图6为本专利技术纯化蛋白明胶电泳图(1为纯化后HC， 2为未纯化的 表达上清，3为空载体对照)。 具体卖施方式下面通过具体的实施例进一步说明本专利技术是如何实现的 实施例1 重组质粒的构建 1. 1皮蝇素C基因的扩增如图1所示，根据已报道的HC序列(Moire， N 1994， GeneBank ID: X74306如SEQ ID NO: 1所示)，设计一对含EcoR I和Not I酶切位点 的引物hp 1: GC AGAATTC ATAATC AATGGATACGAAG hp2: GCAAGCGGCCGCTTAAAATATTATACCAG按常规方法进行PCR扩增pGEM—T/HC上的HC基因。PCR参数 94°C 5min， 94°C 45s， 50°C 45s， 72°C lmin，共30个循环；72°C延 伸10min。将PCR产物通过TA克隆连接到pMD18-T Vector上，PCR 鉴定正确后测序。 1.2 pPIC9k-HC的构建用EcoRI和Notl (购自TaKaRa)分别酶切重组载体pMD18-T/HC 和表达载体pPIC9k(上海农科院生物技术中心提供)，37。C水浴过夜后终止反应，用DNA胶回收试剂盒(购自上海申能博采公司)回收HC相 应片段和pPIC9k， T4连接酶16。C连接过夜。 1.3重组质粒的鉴定将重组产物转化入感受态大肠杆菌DH5 a (本实验室保存)中，挑 取氨苄抗性克隆(100mg/ml)，接种于LB培养基，37"C振荡培养过夜， 提取重组质粒，经酶切和PCR鉴定正确后测序。如图2所示，重组质粒经PCR及酶切均证实了片段的正确插入， 测序结果(如SEQIDNO: 2所示)表明未有发生碱基移码、丢失和增 加。''实施例2 重组质粒的转化和筛选 2.1重组质粒的转化重组质粒经SalI酶切(37°C 5h)使之线性化，1.5kv，200KQ,25uF 电击转化入制备好的感受态酵母细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用毕赤酵母生产皮蝇素Ｃ的方法，其特征在于：所述的方法包括如下步骤：　　　　（１）根据皮蝇素Ｃ基因全长ｃＤＮＡ序列，设计含ＥｃｏＲ　　Ｉ和Ｎｏｔ　　Ｉ酶切位点的特异性引物，用ＰＣＲ扩增出如ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１所示的皮蝇素Ｃ基因，用ＥｃｏＲ　　Ｉ和Ｎｏｔ　　Ｉ分别酶切重组载体和片段皮蝇素Ｃ基因，并用连接酶将其连接，形成含有皮蝇素Ｃ基因的重组质粒，将重组产物转入大肠杆菌，酶切、ＰＣＲ鉴定、测序确认；　　　　（２）将含有皮蝇素Ｃ基因的重组质粒以Ｓａｌ　　Ｉ进行酶切，线性化后的重组质粒通过电击转化入制备好的酵母感受态细胞中进行培养，筛选出多拷贝质粒菌株；　　　　（３）对筛选出的细胞进行培养，待菌液ＯＤ６００值达２－６时离心收集细胞，然后进行诱导表达；　　　　（４）将收集的上清液浓缩后，于缓冲液中透析、过滤，用阴离子交换层析柱纯化透析蛋白，收集含目的蛋白的洗脱液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：何国声，高兴春，徐梅倩，郭敏，曹杰，朱顺海，赵其平，黄燕，庞程，李家诚，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]