检测硝基咪唑类药物的方法及其专用酶联免疫试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种检测硝基咪唑类药物的方法及其专用酶联免疫试剂盒。该试剂盒，包括硝基咪唑类特异性抗体及包被原和酶标记物；所述硝基咪唑为下述四种中的至少一种：甲硝唑、替硝唑、二甲硝咪唑和洛硝哒唑。本发明专利技术方法，具有样品前处理过程简单、操作简便、费用低廉、特异性好、灵敏度高、精确度强等特点，能够现场监控且适合大量样本的筛查。因此本发明专利技术检测方法及其专用试剂盒将在动物源性食品中硝基咪唑类药物的残留检测中发挥重要作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及检测硝基咪唑类药物的方法及其专用酶联免疫试剂盒。
技术介绍
硝基咪唑类药物有甲硝唑、甲硝磺唑、氯甲硝哒唑、洛硝哒唑和二甲硝咪唑等， 其化学结构通式如图l所示(图中，当R1和R2均为甲基时，药物为二甲硝咪唑，当R1为H， R2为乙醇基时，药物为甲硝唑)。本类药物常被用于预防和治疗特定病菌 和原生动物疾病，其原理是本类药物抑制原虫氧化还原反应，使病原体氮链断裂， 在体外有明显的杀灭阿米巴原虫和抗厌氧菌作用，对各部位的阿米巴均有效，口服 后迅速吸收，广泛分布于体内各器官和大多数体液中。但因其具有潜在的致癌性、 诱导有机体突变性，欧盟和我国已禁止在任何食品动物中使用该类药物。目前测定硝基咪唑类药物方法主要有高效液相色谱法、液相色谱串联质谱等 等，其操作繁琐复杂且费用高，推广应用受到限制。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种检测硝基咪唑类的酶联免疫试剂盒。 本专利技术所提供的检测硝基咪唑类的酶联免疫试剂盒，包括硝基咪唑类特异性抗 体及包被原和酶标记物；所述包被原为硝基咪唑类半抗原与载体蛋白的偶联物或抗 抗体；所述酶标记物为酶标抗抗体或酶标硝基咪唑类半抗原；当所述包被原为硝基 咪唑类半抗原与载体蛋白的偶联物时，所述酶标记物为酶标抗抗体；当所述包被原 为抗抗体时，所述酶标记物为酶标硝基咪唑类半抗原；所述硝基咪唑类为下述四种 中的至少一种甲硝唑、替硝唑、二甲硝咪唑和洛硝哒唑。为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括硝基咪唑标准溶液、 显色液、浓縮洗涤液、终止液、浓縮复溶液；所述硝基咪唑标准溶液为甲硝唑标准 溶液。所述浓縮洗涤液可以为含有0. 8%-1. 3%(质量百分含量)吐温-20和0. 03-0. 07% (质量百分含量)叠氮化钠、pH值为7.0-7.4、 0.02-0.05M的磷酸盐缓冲液；所 述浓縮复溶液可以为pH值为7. 0-7. 4、 0. 1-0. 3M的磷酸盐缓冲液；当标记酶为辣 根过氧化物酶时，所述显色液由显色液A液和显色液B液组成，显色液A液可以为过氧化氢或过氧化脲，显色液B液可以为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液可以为 1 2M硫酸或盐酸溶液；当标记酶为碱性磷酸酯酶时，显色液可以为硝基磷酸盐缓 冲液，终止液可以为1 2M氢氧化钠溶液；所述百分含量为质量百分含量。所述硝基咪唑类半抗原为洛硝哒唑半抗原；所述洛硝哒唑半抗原是将如下所示化合物①和戊二酸酐通过縮合反应得到的。上述硝基咪唑类半抗原是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能 诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。本专利技术采 用碳化二亚胺法将前述半抗原与载体蛋白偶联，突出了硝基咪唑药物的共有特征结 构，同时也增加了该半抗原的免疫原性和特异性。其中，洛硝哒唑半抗原与载体蛋 白的结合比例过低或过高都对免疫不利，半抗原与载体蛋白(如血蓝蛋白)的结合摩尔比为(8-10) :1。所述硝基咪唑类特异性抗体为洛硝哒唑单克隆抗体；所述单克隆抗体是由保藏 号为CGMCC No. 2545的对硝基咪唑类药物的单克隆杂交瘤细胞株C-2-2分泌的抗体；所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体。所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，其中优选为辣根过 氧化物酶。所述浓縮洗涤液具体可以为含有1.0% (质量百分含量)吐温-20和0.05% (质 量百分含量)叠氮化钠、pH值为7.4、 0.05M的磷酸盐缓冲液；所述浓縮复溶液可 以为pH值为7. 2、 0. 2M的磷酸盐缓冲液。当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述显色液由显色液A液和显色液B液组成， 显色液A液可以为过氧化氢或过氧化脲，显色液B液可以为邻苯二胺或四甲基联苯 胺，终止液可以为1-2M硫酸或盐酸溶液；当标记酶为碱性磷酸酯酶时，显色液可 以为硝基磷酸盐缓冲液，终止液可以为l-2M氢氧化钠溶液；所述百分含量为质量 百分含量。在洗涤液中加入一定量吐温-20和叠氮化钠的作用在于缓冲液中吐温-20会减 少抗体的非特异性吸附，还能对蛋白起到一定的保护作用，加入叠氮化钠后，则叠氮钠在溶液中抑制细菌的生长，对溶液的稳定性其到一个保护作用。 本专利技术的另一个目的是提供一种检测硝基咪唑类药物的方法。 本专利技术所提供的检测硝基咪唑类药物的方法，包括以下步骤1) 样品前处理样品的前处理主要是为了从样品中获得硝基咪唑类溶液，从 而用于后续的检测。取2.0g动物组织匀浆物，向其中加入50ml聚苯乙烯，加入3 ml 0. 15-0. 25M 的氢氧化钠溶液和6-10ml乙酸乙酯，混匀，室温以3000g以上的速度离心至少5min， 取上层液体，每4ml上层液体中，加入0. 5-1. 5ml正己垸和400-600|Ld浓縮复溶液， 混匀，室温以3000g以上的速度离心，收集下层液；所述乙酸乙酯优选为8ml;所 述正己烷优选为lml;所述浓縮复溶液优选为500)il;所述氢氧化钠溶液的浓度优 选为0.2M ，体积优选为2 ml;2) 利用权利要求l一7中任一所述的酶联免疫试剂盒检测步骤1)中的下层液。3) 分析检测结果。由保藏号为CGMCC No. 2545的对硝基咪唑类药物的单克隆杂交瘤细胞株C-2-2 分泌的洛硝哒唑单克隆抗体也属于本专利技术的保护范围。保藏号为CGMCC No. 2545的对硝基咪唑类药物的单克隆杂交瘤细胞株C-2-2也 属于本专利技术的保护范围。本专利技术的酶联免疫试剂盒主要采用间接竞争ELISA方法定性或定量检测硝基 咪唑类药物的残留量。试剂盒主要内容物采用了方便使用的工作液形式，其保存性 及稳定性好；利用本专利技术试剂盒检测硝基咪唑类药物残留量的方法，可用于检测动 物组织如鸡肉、鸡肝、猪肉、猪肝、鱼、虾等样品中硝基咪唑类药物的残留量，具 有样品前处理过程简单、操作简便、费用低廉、特异性好、灵敏度高、精确度强等 特点，能够现场监控且适合大量样本的筛査。因此本专利技术检测方法及其专用试剂盒 将在动物源性食品中硝基咪唑类药物的残留检测中发挥重要作用。 附图说明图1为硝基咪唑类药物的化学结构通式。图2为洛硝哒唑水解产物。图3为硝基咪唑类半抗原的合成。图4为以硝基咪唑类半抗原和载体蛋白的偶联物为包被原的试剂盒的标准曲线。图5为以抗抗体为包被原的试剂盒的标准曲线。 具体实施例方式下述实施例的方法如无特别说明，均为常规方法。 下述实施例中各试剂盒的检测原理如下当在酶标板微孔条上预包被硝基咪唑类药物半抗原与载体蛋白的偶联物时，加 入样本溶液或标准品溶液后，再加入硝基咪唑类药物抗体溶液，样本中残留的硝基 咪唑类药物或甲硝唑标准品与酶标板上包被的硝基咪唑类药物偶联抗原竞争硝基 咪唑类药物抗体，加入酶标记抗抗体进行放大作用，用显色液显色，样本吸光值与 样本中硝基咪唑类药物的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中硝基咪唑 类药物的残留量。同时也可根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度标准品溶液颜色 的比较可粗略判断样品中硝基咪唑类药物残留量的浓度范围。当在酶标板微孔条上预包被抗抗体时，加入硝基咪唑类药物抗体孵育后，加入 样本溶液或标准品溶液，再加入酶标记硝基咪唑类药物抗原溶液，样本中残留的硝 基咪唑类药物或甲硝唑标准品与酶标记甲硝唑抗原竞争抗体，用显色液显色，样本 吸光度值与样本中硝基咪唑类药物的含量成负相关本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测硝基咪唑类的酶联免疫试剂盒，包括硝基咪唑类特异性抗体及包被原和酶标记物；所述包被原为硝基咪唑类半抗原与载体蛋白的偶联物或抗抗体；所述酶标记物为酶标抗抗体或酶标硝基咪唑类半抗原；当所述包被原为硝基咪唑类半抗原与载体蛋白的偶联物时，所述酶标记物为酶标抗抗体；当所述包被原为抗抗体时，所述酶标记物为酶标硝基咪唑类半抗原；所述硝基咪唑类为下述四种中的至少一种：甲硝唑、替硝唑、二甲硝咪唑和洛硝哒唑。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：沈建忠，何方洋，丁双阳，冯才伟，万宇平，冯静，汪善良，朱亮，罗晓琴，
申请(专利权)人：北京望尔康泰生物技术有限公司，北京望尔生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]