本发明专利技术提供了一种液相层析串联质谱法定量检测生物样本中丹参素的方法，包括步骤（１）样品制备和步骤（２）检测，其特征在于步骤（１）中的样品制备采用包括如下步骤的方法：ａ．在待测样本中加入酸性物质，调节其ｐＨ值至小于等于５，并混匀；ｂ．加入１倍或１倍以上体积的不与水混溶的，且沸点低于２５０℃的有机溶剂，并混匀；ｃ．离心，收集有机溶剂层，转移到另一容器中并蒸干有机溶剂；ｄ．步骤ｃ的干燥物用步骤（２）所用的流动相重新溶解。本发明专利技术的方法，快速、灵敏、选择性高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及药品检验领域，特别涉及生物样本中有效成分的检验。
技术介绍
丹参为唇形科鼠尾草属多年生草本植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bge)的干燥根，其活性 成分主要包括脂溶性成分和水溶性酚酸类成分，前者主要包括丹参酮IIA、丹参酮I和隐丹参酮等； 后者主要包括丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、丹酚酸B和丹酚酸C等。丹参，特别是多种复方药物的 重要组成成份，广泛地用于冠心病、肝炎、月经紊乱、闭经、血液循环障碍,和其它心脑血管疾 病的治疗。20世纪早期的研究主要集中在以丹参酮为代表的脂溶性成分方面，但丹参的传统应用 方式为水煎液，因此，其有效成分多以水溶性物质为主。丹参素，化学名称为fi-3， 4-二羟苯乳酸(3， 4-hydroxybenyl lactic acid)，作为水溶性 成分主要的活性物质，不仅具有扩张冠状动脉，抗缺氧、减少细胞中胆固醇合成的作用，还能抑 制低密度脂蛋白氧化。以前的研究表明可以用高效液相色谱/紫外技术(HPLC/UV)、高效液相色谱/荧光技术 (HPLC/LF)或者液相层析串联质谱技术(LC/MS/MS)检测生物样本中的丹参素。HPLC/UV技术已用 于检测大鼠血桨或者人尿液中丹参素的含量，其缺点是灵敏度较低，最低定量限(Lower Limit of quantitation, LLOQ)》50ng/ml，并且需要的检测样本比较大(》0. 25ml) 。 HPLC/LF法检测的 灵敏度也不高(LL0Q约为125ng/ml)并且检测所需时间较长(检测每个样本至少需要15分钟)。质谱检测器是以分子量测定为基础的分析方法，近年来，其与高效液相层析法(HPLC)或毛 细管电泳法(CE)等分离机制的联用不仅提高了其抗杂质干扰的能力和节省了分析时间，而且大 大提高了测定的灵敏度。软电离技术，如电喷雾离子化技术(ESI)的发展，则扩大了分子量检 测的范围。此外，电喷雾离子化技术可在大气压下进行，方便与液相层析仪连结，使液相层析质 谱联用技术(LC/MS)成为了一种高灵敏度、高选择性且快速分析的技术，其能在短时间之内， 同时实现分析物的分离与结构鉴定。通过液相层析质谱联用技术(LC/MS/MS)能更清楚地了解药 物在动物活体内的药物动力学规律，从而让研究人员能够更好地掌握药物的药理作用。另外还可以省去复杂、繁琐且耗时的样本前处理工作。Li等(Li XC, Yu C， Cai YB, Liu GY， Jia JY, Wang YP. J. Chromatogr, B 2005; 820: 41.) 建立了一种LC/MS/MS检测体液中的丹参素的方法，他们用甲酸(蚁酸)/丙酮/水溶液来提取血清中 的丹参素，LL0Q提高到8ng/ml。然而，为了研究丹参，特别是含有丹参的复方药物的药代动力学， 需要更加灵敏的测定方法。
技术实现思路
本专利技术提供了一种灵敏的定量检测生物样本中丹参素的方法。本专利技术提供的方法，是采用液相层析串联质谱技术定量检测生物样本中丹参素的方法，包括 步骤(1)样品制备和步骤(2)检测，其特征在于步骤(1)中的样品制备采用包括如下步骤的 方法a. 在待测血浆样品中加入酸性物质，调节其PH值至小于等于5，并混匀；b. 加入l倍或l倍以上体积的不与水混溶的，且沸点低于25(TC的有机溶剂,并混匀；c. 离心，收集(去除)有机溶剂层，转移到另一容器中并蒸干有机溶剂；d. 步骤c的干燥物用步骤(2)所用的流动相重新溶解。按照上面的描述，本专利技术的方法的产品制备步骤，本领域的人员不需要创造性的劳动就可完 成。液相层析串联质谱技术(LC/MS/MS)可采用现有的商品化的仪器设备根据产品说明实施，这 是本领域的技术人员不需要创造性的劳动就可以完成的。通过调节生物样本的PH值，使丹参素以 分子的形式，而非离子的形式存在，从而更完全的被有机溶剂萃取，然后收集并蒸干有机溶剂层， 用流动相重新溶解后，注入液相层析质谱联用系统(LC/MS/MS)进行分析。本专利技术的方法，其中所述的生物样本可以是任何种类的生物样本，包括但不限于血液(血衆、 血清)，体液，尿液，组织匀浆等，优选血浆。本专利技术的方法，其中步骤a所述的酸性物质是强酸，包括但不限于盐酸、硫酸、高氯酸，磷 酸，甲酸，乙酸等，优选盐酸。本专利技术的方法，其中步骤a调节pH值优选至小于等于4，更优选调节至小于3，最优选调节至 0.5;步骤b是加入2倍或2倍以上体积的有机溶剂，最好是加入15倍体积的有机溶剂；步骤b所述 的有机溶剂可以是任何不与水混溶的，且沸点低于25(TC的有机溶剂，包括但不限于乙酸乙酯， 乙醚，丙酮等，最优选乙酸乙酯。优选地，本专利技术的方法，步骤a加入的酸是盐酸，调节其pH值至0.5,步骤b是加入i;5倍体积的乙酸乙酯。优选地，本专利技术的方法，检测方式优选地为采用电喷雾模式，负离子选择性反应监测，以阿 魏酸作为内标。用于定量分析的母/子离子对分别为m/z 196.8—134. 8(丹参素)和m/z 192.8— 133.8(阿魏酸)，参数可以选择仪器推荐的参数进行，也可以进一步优化。丹参素和阿魏酸的特 征性质谱图见图1和图2。本专利技术的方法，层析可以采用本领域常用的反相色谱柱，可以使用该色谱柱推荐的参数，也 可以进一步优化，使用的色谱柱优选Inertsil 0DS-3色谱柱，流动相优选pH为小于等于6. 5的甲 醇甲酸铵缓冲液，其中甲醇甲酸铵的体积比为98:2 2:98;优选地，层析时流动相采用的是 pH为4. 0的甲醇甲酸铵缓冲液，其中甲醇甲酸铵的体积比30:70。本专利技术的方法，快速、灵敏、选择性高。每天可以检测150多个样品。特别是灵敏度高，可 以检测的血浆丹参素的LL0Q为5ng/ml。附图说明图l丹参素的特征性质谱图 图2阿魏酸的特征性质谱3 口服丹参提取物后，平均血浆丹参素浓度-时间曲线具体实施方式下面是一个采用本方法进行的药代动力学研究的实施例，结合实施例，对本专利技术的作进一步 的说明。实施例只是为了方便理解本专利技术，而不对本专利技术构成任何限制。 实施例l 实验方法丹参提取物，制备成2%的水溶液，给大鼠口服，剂量为200mg/kg，每个大鼠分别在服药后的 0、 5、 10、 20、 30、 45、 60、 90、 120、 150、 180、 240和360分钟抽取静脉血样250 u 1，置于肝 素化的试管中，血样立即离心10,000g， 5分钟得到血浆。标记并保存于-2(TC待检。最大血药浓度(Cmax)和达峰时间(Tmax)均以实测值表示，曲线下面积(AUC。')以梯形 法计算，AUC—按公式计算AUC一 = AUGh+G/入z (t为最后一次可实测血药浓度的采样时间； G为末次可测定样本药物浓度；"系对数浓度-时间曲线末端直线部分求得的末端消除速率常数， 可用对数浓度-时间曲线末端直线部分的斜率求得)；W2用公式kf0. 693/ A z计算。仪器LC/MS/MS系统包括Surveyor质谱泵，美国Surveyor自动加样器(ThermoF:innigan， USA)， ThermoFinnigan TSQ Quantum三级四极杆质谱联用仪(San Jose， CA, USA)，配有电喷雾离子 源(ESI);数据分本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种液相层析串联质谱法定量检测生物样本中丹参素的方法，包括步骤（１）样品制备和步骤（２）检测，其特征在于步骤（１）中的样品制备采用包括如下步骤的方法：ａ．在待测样本中加入酸性物质，调节其ｐＨ值至小于等于５，并混匀；ｂ．加入１倍或１倍以上体积的不与水混溶的，且沸点低于２５０℃的有机溶剂，并混匀；ｃ．离心，收集有机溶剂层，转移到另一容器中并蒸干有机溶剂；ｄ．步骤ｃ的干燥物用步骤（２）所用的流动相重新溶解。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李伟，韩建平，高钧，
申请(专利权)人：天津天士力制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]
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