本发明专利技术提供一种在醇类溶液中测量甲醇含量的方法及装置。本发明专利技术是以酶反应为基础的电化学甲醇检测用生物微传感器，并可针对真实酒类样品中甲醇的含量，进行快速且灵敏的检测，可达到省时省成本的效果，并大幅提升使用上的方便性。本发明专利技术可直接用于假酒的筛检，进而达到避免假酒中毒事件发生的目的。
【技术实现步骤摘要】
一种在醇类溶液中测量甲醇浓度的方法及装置
本专利技术涉及一种检测醇类溶液中的甲醇含量的方法与装置，并尤 其涉及利用双酵素系统检测酒类溶液中的甲醇含量的方法与装置。
技术介绍
假酒中毒事件时有所闻，主要原因乃在于酒中掺入了高浓度甲 醇，以致于有些人饮用后失明，甚至是死亡。甲醇又称木精或工业用酒精，常作为溶剂或许多其它工业上用途；甲醇也可用作燃料、制作 私酒、油漆除去剂及变性剂，但真酒中也含有微量的甲醇。甲醇在肝脏中因醇类脱氢酶的催化反应，逐步氧化为甲醛与甲 酸。然而，甲醛毒性约为甲醇的33倍，甲酸则约为甲醇的6倍。急 性甲醇中毒的症状主要有三(l)中枢神经的抑制。(2)严重的代谢性 酸中毒。(3)视神经变化。当甲醇中毒时， 一般可给予摄取大量的乙 醇，因乙醇可和甲醇竞争醇类脱氢酶，因而使身体有足够时间来排除 未经变化的甲醇，同时阻止甲醇经代谢作用后产生甲醛及甲酸。因此 真酒(乙醇)可治療假酒(甲醇)中毒。目前有相当多量测酒中甲醇含量的测定方法，主要包括比色/ 呈色法及气相层析法。其中最普偏使用的方法为铬变酸氧化呈色法， 此法为农业化学家协会(Association of Official Agricultural Chemists, AOAC)公定标准方法。然而，此法有着必须严格的控制反应条件才 能获得良好的定量结果，且检品中若存在醣类会导致分析结果产生正 偏差的缺点。除此之外，此法样品需经过蒸馏等麻烦的前处理，分析 一个样品需耗4小时以上，且使用的药品及试剂具有高毒性，对健康说明书第2/13页及环境的影响甚大，并不适合推广到一般大众。气相层析法虽可对酒类样本提供各成份精确的检测，然而由于其前处理及分析步骤极为冗长；加以仪器本身价格昂贵、体积庞大，且 需要经过专业训练的人员才能操作，导致检测成本过高，基本上并不 符合贩卖商与一般大众实时筛检的需求。生物传感器(biosensor)主要是由生物辨认组件及信号传输组件所 构成。由传统酶电极的概念加以放大，目前举凡牵涉到生物催化与生 物亲和力者都可在生物传感器的应用范围内。生物传感器更具有下列 诸多的优点，可克服传统分析方法的缺失，因此深具发展潜力。生物 传感器的优点包括(1)经由固定化技术的应用，生物辨认组件可重 复使用，降低成本；(2)生物辨认组件专一性高，可避免非标的物干 扰；(3)操作简易；(4)灵敏度高，所需样品量低；(5)应答快速，降 低分析时间；(6)数位信号输出，达到微小化，易携带，可用于现场 检测。有鉴于此，开发一个能够快速筛检甲醇浓度，同时兼具可携带、 操作简便与廉价特性的生物微传感器(Micro-biosensor)，成为抑制假 酒中毒事件扩散的利器。目前市面上甲醇/乙醇快速检测仪器也属于生物传感器的种。其主 要利用醇类氧化酶(Alcohol Oxidase, AOX)可氧化甲/乙醇，产生H202，进而利用外加电压(或结合过氧化酶)的模式，将H202氧化，释出电子，由产生的电流信号变化来量化甲/乙醇的浓度。此法主要的缺点 在于醇类氧化酶除了可对甲醇作用之外，也同时可氧化乙醇，也即无 法辨别甲/乙醇共存的情况，因此无法用于假酒的筛检。NADH是生物细胞内的高还原性化合物，主要作为生物细胞内酶 的辅酶(coenzyme)，提供酶反应必要的氢原子，然后氧化为NAD+。 一般的氧化还原酶都需以NAD(H)作为辅酶，才能驱使反应的进行。 恋臭假单胞菌(Pseudomonas putida)非麸氨基硫(glutathione-independent)相关的甲醛脱氢酶(formaldehyde dehydrogenase, FDH)有着不需透过麸氨基硫作为辅酶，直接将 NAD+(nicotinamide adenine dinucleotide)与甲醛转化成甲酸与高价 NADH的优点。由于NADH具备高还原性，可广泛的应用在工业与 民生用途之中。台湾专利申请号第096116235号专利，则透过对甲醛 脱氢酶基因序列进行突变，造成胺基酸序列出现改变，达到提升酶活 性与提升对基质专一性的效果，同时降低酶使用成本。因此，本专利技术将分子生物技术与电化学式酶生物传感器的概念相 结合，开发生物微传感器来检测液态或酒类样本中的甲醇/甲醛含量。 应用本专利技术所生产的传感器产品可供检验单位、酒类贩卖商乃至于一 般家庭民众直接用于市面上假酒的筛检，进而达到避免假酒中毒事件 发生的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种在(醇类)溶液中测量甲醇含量的方 法，其包括利用醇类氧化酶(AOX)将该溶液中的甲醇氧化成甲 醛；在NAD+共同参与下，利用甲醛脱氢酶(FDH)将该甲醛氧化成 甲酸，并将NAD+还原成NADH;并以一电子媒介物与该NADH发 生反应，将该NADH氧化为NAD+，同时该电子媒介物经还原后进 行自氧化反应而释出电子，形成氧化电流；再量测氧化电流，并将该 所量测的电流代入预先建立的甲醇浓度与电流线性方程式中，以决定 该溶液中的甲醇含量。本专利技术的另一目的在于提供一种甲醇测量装置，其用于测量溶液 中甲醇的含量，而该装置包括 一基板；位于该基板上的参考电极； 位于该基板上且不接触至该参考电极的工作电极，而该工作电极包括 工作区域，该工作区域中包括有醇类氧化酶、甲醛脱氢酶、以及电子 媒介物以及位于所述基板上且不接触至所述参考电极与所述工作电极的活性区域，而该活性区域中包括有NAD+。本专利技术的又一 目的在于提供一种利用甲醇测量装置测量待测样 品中的甲醇浓度的方法，而该方法包括(l)用该甲醇测量装置接触 起始电解质溶液，并测量该起始电解质溶液的起始电流值(Ii); (2) 加入预定量的待测样品至该起始电解质溶液中，并测量最终电流值 (If); (3)计算该起始电流值与该最终电流值的差异值(Ii-If)而得到 AI值；(4)将该AI值代入预先建立的甲醇浓度与电流方程式中，以 决定该样品中甲醇浓度。本专利技术的优点在于提供结合分子生物技术、酶固定与电化学相关 技术，利用改质过的甲醛脱氢酶提升其对于甲醛的专一性，因而应用 于以酶反应为基础的电化学甲醇检测用生物微传感器，并可针对真实 酒类样品中甲醇的含量进行快速且灵敏的检测，可达到实时且低成本 传感器的目的，并大幅提升使用上的方便性。本专利技术的检测装置可直 接用于假酒的筛检，进而达到避免假酒中毒事件发生的目的。并可供 检验单位、酒类贩卖商，乃至于一般民众进行酒类质量的控管，达到 人体健康维护的目的。经由下述详述的说明书并参照相关图式，本专利技术在前述及其它相 关目的、特征和优点会而更显清楚。附图说明图1用以说明依据本专利技术测量甲醇含量的方法。图2用以说明依据本专利技术SPE电极的结构与例示尺寸。图3A用以说明依据本专利技术针对固定浓度甲醇，未使用雷氏盐制备SPE电极连续测量甲醇含量的电流输出信号图。图3B用以说明依据本专利技术针对固定浓度甲醇，使用雷氏盐制备SPE电极连续测量甲醇含量的电流输出信号图。图4A至图4C用以说明依据本专利技术以不同的MB-RS:碳胶比例固定，测试其在不同甲醇浓度下的电流差值图。图5用以说明依据本专利技术针对不同比例AOX/FDH制备的电极， 于相同NAD+与甲醇浓度条件下测量的电流输出信号图。图6用以说明依据本专利技术将NAD+本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种在醇类溶液中测量甲醇含量的方法，其包括： （１）利用醇类氧化酶将该溶液中的甲醇氧化成甲醛； （２）在ＮＡＤ↑［＋］共同参与下，利用甲醛脱氢酶将该甲醛氧化成甲酸，并将ＮＡＤ↑［＋］还原成ＮＡＤＨ； （３）使电子媒介物与该ＮＡＤＨ发生反应，将该ＮＡＤＨ氧化为ＮＡＤ↑［＋］，同时该电子媒介物经还原后进行自氧化反应而释出电子，形成氧化电流；以及 （４）测量该氧化电流，并将该所量测的电流代入预先建立的甲醇浓度与电流线性方程式中，以决定该溶液中的甲醇含量。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：巫鸿章，钱瑞龙，陈建孝，林毕修平，
申请(专利权)人：财团法人生物技术开发中心，
类型：发明
国别省市：71[中国|台湾]
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