一类不对称菁类荧光染料制造技术

本发明专利技术提供了一种式Ⅰ的不对称菁类荧光染料，其中Ｘ、ｎ、Ｒ↓［１］、Ｒ↓［２］、Ｒ↓［３］、Ｒ↓［４］、Ｒ↓［５］和Ｙ↑［－］如说明书中的定义。本发明专利技术还提供了该荧光染料的缀合物、制备方法、包含这种荧光染料的组合物和使用这种荧光染料或其组合物进行生物染色的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及适合用于核酸染色的染料，更具体地说涉及不对称 菁类荧光染料。
技术介绍
荧光检测技术在DNA杂交测试、基因重组测试、免疫检测、血 细胞分析和紳瘤细胞早期诊断等方面的广泛应用极大地促进了荧光 染料的发展。最早应用于生物分析的荧光染料为吖啶、菲啶类染料， 如吖啶橙、溴乙锭等，它们通过嵌入或静电吸引与DNA小分子结合， 结合后荧光大大增强。但未结合染料的自身荧光会造成高的荧光背 景，从而干扰检测。同时溴乙4定等有很大的毒性和致癌性，因此它 们已逐渐被其它荧光染料代替。目前，使用比较多的有罗丹明、荧光素类、BODIPY类和菁类 荧光染料。菁类荧光染料首先由Williams发现，至今已有150年的 历史，如今作为生物荧光检测探针、CD和VCD记录材料、感光材 料光敏剂、光电转换材料等已被广泛的应用，其中作为生物分子的 荧光探针用于检测核酸、蛋白质等尤其成为关注的焦点。菁染料曱川链两端的含氮芳香母核有很多种类，包括噻唑、噻 吩、2-喹啉、4-喹啉和3H-吲哚啉等。按其相同与否可分为对称和不 对称两类。其中，不对称菁染^f主要应用于物理结合荧光标示，与 核酸的结合方式包括静电吸引、碱基对嵌入及沟槽结合。具体的结 合方式取决于染料的结构及染料与核酸浓度的比例。不对称菁染料 中最典型的一类为TOTO及其类似物和衍生物类。TOTO (p塞唑橙二 聚体)、YOYO (恶唑黄二聚体)是由Glazer研究组开发的一类对核酸具有高度亲和力的多正电荷不对称菁类荧光染料，通过改变多亚曱 基链两端的染料分子可以得到不同的异二聚体类似物和衍生物。这 类染料在溶液中无荧光，与核酸结合后焚光增强，因此降低了检测过程中的荧光背景干扰。Jason等用溶液粘度测定法和原子力显微镜 解释了 TOTO和YOYO与DNA的双嵌入作用。 Ftirstenberg等利用超快速荧光转换和时间相关单光子计 数法进 一 步阐述了荧光增强的动力学机理。但是此类染料的光i普在可见光区(490-530 nm),而生物样品在这个区域有很强的吸收和荧光发射，这会造成荧光检测效率 大大降低。尽管通过增加共轭链数可以使染料的吸收和发射波长产 生红移达到近红外区(WO-IOOO nm)，如TOTAB、 TOTIN、 TO-PRO-3、 PO-PRO-2和BO-PRO-2等,但这类染料一般分子较大，结构 复杂，合成步骤多，因而使其商品化受到了限制。此外，随着曱川链的增长，菁染料的光稳定性逐渐下降，因此 需要进一步提高长波长菁染料的光稳定性。美国专利6004816描述了一种用于分类和计数白细胞的试剂， 其中包含的荧光染料特异性结合RNA而增加其荧光强度。但是这种 焚光染料的光稳定性仍然不足，容易造成实验误差。美国专利公开2003/0145394公开了 一种氦-氖激光器可激发的荧 光染料，其用于检测和计数网织红细胞。这种荧光染料需要昂贵的 氦-氖激光器，实际应用的设备成本较高。因此，需要开发新的荧光染料，该荧光染料优选具有以下性质 在不存在核酸时不发荧光，而在存在核酸时具有良好的荧光量子产 率；具有一定水平的水溶性，同时具有一定的穿过细胞膜的能力； 光谱范围与生物样品的光谱范围有较大差异。
技术实现思路
在一个方面，本专利技术结合现有的各类菁染料的优点，在其基础上改进，提供了一类不对称菁类荧光染料，其具有下列结构通式I:其中n为1 、 2或3;X为C(CH3)2、 O、 S或Se;R,和R2各自独立选自H、 C^烷基、-(:1.6烷基-0115或卣素； Rs为H、 Cw烷基、OR5、 -&.6烷基-0115、 COOR5、 N02、 CN 或卣素；&为Cw烷基、-CVJ^l-OR"苄基或卤素，所述苄基由选自 以下的取代基任选取代卣素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、 芳基、烷氧基、杂环基、卣代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧 基；Rs为H或C,.,8烷基； Y为负离子。优选n为l或2，更优选n为l。优选X为C (CH3)2、 O或S;更优选X为C (CH。2或S;最优 选X为S。优选1^和R2各自独立选自H、 C,.)8烷基或卣素；更优选R,和 R2各自独立选自H或Cws烷基；再更优选R,和R2各自独立选自H 或Cl12烷基；再更优选&和R2各自独立选自H或CV6烷基；最优 选R,和R2均为H。优选R3为H、 Cw8烷基、OR5、 COORs或面素；更优选R3为H、 <^.12烷基、OR5、 COORs或卤素；最优选R3为H、 C^烷基、OR5、 COORs或囟素。优选R4为Cl18烷基、千基或卣素，所迷千基由选自以下的取代 基任选取代卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧 基、杂环基、卣代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；更优选114 为C^8烷基或者苄基，所述苄基由卤素、羟基、巯基、氰基、硝基 或氨基任选取代；更优选R4为Cw2烷基或者千基，所述千基由面素、 羟基、巯基、氰基、硝基或氨基任选取代；更优选R4为Cl12烷基或 者千基，所述千基由卣素、羟基、巯基、氰基、硝基或氨基任选取 代；最优选R4为Cw烷基或千基，所述千基由面素、羟基、巯基、 氰基、硝基或氨基任选取代。优选115为H或Cw烷基，更优选Rs为H或C^烷基。 优选Y-为卤素离子、C104-、 PF6—、 CF3S03-、 BF4-、乙酸根或对 甲苯磺酸负离子。在一个实施方案中，本专利技术还提供上述式I化合物的缀合物。 在另一个方面，本专利技术还4是供合成上述式I化合物或其缀合物 的方法。在另一个方面，本专利技术还4是供包含上述式I化合物或其缀合物 的组合物，所述组合物用于生物样品的染色。在另一个方面，本专利技术还4是供使用上述式I化合物或其缀合物 或包含式I化合物的组合物以染色生物样品的方法。本专利技术的这些特征和优点以及其他特征和优点在参考以下附图 和本专利技术的具体实施方式之后将变得显而易见。附图说明图1是化合物A、 B和已知化合物M在乙醇中的光稳定性对比。 横坐标为时间(小时)，纵坐标为吸光度值保留百分数。所用光源为500W碘鴒灯；所用仪器为紫外可见分光光度计，型号Lambda35。 图2是化合物A、 B和已知化合物M在DMSO中的光稳定性对 比。横坐标为时间(小时)，纵坐标为吸光度值保留百分数。所用光 源为500W碘鴒灯；所用仪器为紫外可见分光光度计，型号Lambda 35。图3是化合物A和已知化合物M在乙醇溶液中的吸收光谱和发 射光语。横坐标为波长(nm),纵坐标为吸光度和荧光强度的归一化 数值。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号Lambda 35;荧光分 光光度计，型号LS55。—图4是化合物B和已知化合物M在乙醇溶液中的吸收光谱和发 射光语。横坐标为波长(nm)，纵坐标为吸光度和荧光强度的归一化 数值。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号Lambda 35;荧光分 光光度计，型号LS55。图5是化合物A在含不同浓度pET-32a (+)质粒DNA的水溶液 中的焚光发射光i普。横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。化合 物A的浓度为3.3 nM。箭头表示DNA的浓度(ng/mL)变化从小到大 依次为0、 6.67、 13.33、 20、 26.67。所用仪器为荧光分光光度计本文档来自技高网...

【技术保护点】
一类荧光染料，所述染料具有如下结构通式Ⅰ：　＊＊＊　Ⅰ　其中　ｎ为１、２或３；　Ｘ为Ｃ（ＣＨ↓［３］）↓［２］、Ｏ、Ｓ或Ｓｅ；　Ｒ↓［１］和Ｒ↓［２］各自独立选自Ｈ、Ｃ↓［１－１８］烷基、－Ｃ↓［１－６］烷基－ＯＲ↓［５］或卤素；　Ｒ↓［３］为Ｈ、Ｃ↓［１－１８］烷基、ＯＲ↓［５］、－Ｃ↓［１－６］烷基－ＯＲ↓［５］、ＣＯＯＲ↓［５］、ＮＯ↓［２］、ＣＮ或卤素；　Ｒ↓［４］为Ｃ↓［１－１８］烷基、－Ｃ↓［１－６］烷基－ＯＲ↓［５］、苄基或卤素，其中苄基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；　Ｒ↓［５］为Ｈ或Ｃ↓［１－１８］烷基；　Ｙ↑［－］为负离子。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：彭孝军，吴彤，樊江莉，孙世国，王炳帅，徐兵，邵建辉，
申请(专利权)人：大连理工大学，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]