通过发酵产生(6E)-8-羟基香叶醇的经改造的生物合成途径制造技术

本公开内容描述了改造微生物细胞以用于(6E)‑8‑羟基香叶醇的发酵生产，并提供了新的经改造的微生物细胞和培养物，以及相关的(6E)‑8‑羟基香叶醇生产方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过发酵产生(6E)-8-羟基香叶醇的经改造的生物合成途径相关申请的交叉引用本申请要求2017年12月7日提交的美国临时申请62/596,013的权益，该临时申请以引用的方式全文纳入本文。关于在联邦资助的研究和开发下进行的专利技术的权利的声明本专利技术在DARPA授予的协议号HR0011-15-9-0014下的政府支持下进行。政府对本专利技术拥有一定的权利。以引用的方式纳入序列表本申请包括序列表，该序列表以ASCII格式电子提交并且以引用的方式全文纳入本文。该ASCII副本于2018年12月5日生成，被命名为2018-12-05_ZMGNP007WO_SeqList_ST25.txt，大小为327,680字节。
本公开内容总体上涉及改造微生物以通过发酵产生(6E)-8-羟基香叶醇的领域。
技术介绍
已知(6E)-8-羟基香叶醇(8-羟基香叶醇)是存在于自然界中的无环单萜。已知通过化学合成生产萜烯醇的方法(美国专利4,107,219)。(6E)-8-羟基香叶醇来自基于核心代谢物前体乙酰CoA的甲羟戊酸生物合成途径(图1)。甲羟戊酸生物合成途径中的HMG-CoA还原酶受到反馈抑制[1，2]。8-羟基香叶醇是单萜吲哚生物碱[3]和单萜糖苷的前体(JP2013158298A[4]；美国专利9,518,282)。萜烯已被用于制备新的聚酯材料[5]。已制备了热封萜烯聚合物膜(美国专利3,278,646)。氢化萜烯已被用于聚合物共混物(美国专利3,361,849)。已制备了萜烯树脂和萜烯酚树脂，并将其用作汽车工业的涂层保护膜(美国专利5,643,676)。萜烯已被掺入具有高防潮性能的定向聚丙烯薄膜中，用作包装薄膜材料(美国专利5,500,282)。
技术实现思路
本公开内容提供了经改造的微生物细胞、微生物细胞的培养物以及生产(6E)-8-羟基香叶醇的方法，包括以下实施方案：实施方案1：一种经改造的微生物细胞，其中所述经改造的微生物细胞表达：(a)非天然的香叶基二磷酸二磷酸酶(香叶醇合酶)；和(b)非天然的香叶醇-8-羟化酶；其中所述经改造的微生物细胞产生(6E)-8-羟基香叶醇。实施方案2：实施方案1的经改造的微生物细胞，其中所述经改造的微生物细胞包括一种或多种上游(6E)-8-羟基香叶醇途径酶或上游途径活性调节因子的提高的活性，所述提高的活性为相对于对照细胞的提高。实施方案3：实施方案2的经改造的微生物细胞，其中所述一种或多种上游(6E)-8-羟基香叶醇途径酶选自ATP-柠檬酸合酶、乙酰CoA合酶、硫解酶、羟甲基戊二酰辅酶A合酶(HMG-CoA合酶)、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶)、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶、异戊烯基二磷酸δ-异构酶(isopentenyl-diphosphatedelta-isomerase)和香叶基二磷酸合酶。实施方案4：实施方案3的经改造的微生物细胞，其中所述一种或多种上游(6E)-8-羟基香叶醇途径酶包含异戊烯基二磷酸δ-异构酶。实施方案5：实施方案1-4中任一项的经改造的微生物细胞，其中所述经改造的微生物细胞包括消耗一种或多种(6E)-8-羟基香叶醇途径前体的一种或多种酶的降低的活性，所述降低的活性为相对于对照细胞的降低。实施方案6：实施方案5的经改造的微生物细胞，其中所述消耗一种或多种(6E)-8-羟基香叶醇途径前体的一种或多种酶包括双功能的(2E，6E)-法呢基二磷酸合酶/二甲基烯丙基反式转移酶(dimethylallyltranstransferase)和/或香叶基焦磷酸合酶。实施方案7：实施方案1-6中任一项的经改造的微生物细胞，其中所述经改造的微生物细胞还表达反馈去调控的HMG-CoA还原酶。实施方案8：实施方案1-7中任一项的经改造的微生物细胞，其中所述经改造的微生物细胞包括相对于对照细胞，提高的乙酰CoA的可用性，这是由于乙酰CoA合成率较高和/或乙酰CoA降解率较低。实施方案9：一种经改造的微生物细胞，其中所述经改造的微生物细胞包括：(a)表达非原生的天然香叶基二磷酸二磷酸酶(香叶醇合酶)的方式；和(b)表达非天然的香叶醇-8羟化酶的方式；其中所述经改造的微生物细胞产生(6E)-8-羟基香叶醇。实施方案10：实施方案9的经改造的微生物细胞，其中所述经改造的微生物细胞包括提高一种或多种上游(6E)-8-羟基香叶醇途径酶或上游途径活性的调节因子活性的方式。实施方案11：实施方案10的经改造的微生物细胞，其中所述一种或多种上游(6E)-8-羟基香叶醇途径酶选自ATP-柠檬酸合酶、乙酰CoA合酶、硫解酶、羟甲基戊二酰辅酶A合酶(HMG-CoA合酶)、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶)、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶、异戊烯基二磷酸δ-异构酶和香叶基二磷酸合酶。实施方案12：实施方案11的经改造的微生物细胞，其中所述一种或多种上游(6E)-8-羟基香叶醇途径酶包括异戊烯基二磷酸δ-异构酶。实施方案13：实施方案9-12中任一项的经改造的微生物细胞，其中所述经改造的微生物细胞包括降低消耗一种或多种(6E)-8-羟基香叶醇途径前体的一种或多种酶的活性的方式，所述降低的活性为相对于对照细胞的降低。实施方案14：实施方案13的经改造的微生物细胞，其中所述消耗一种或多种(6E)-8-羟基香叶醇途径前体的一种或多种酶包括双功能的(2E，6E)-法呢基二磷酸合酶/二甲基烯丙基反式转移酶和/或香叶基焦磷酸合酶。实施方案15：实施方案9-14中任一项的经改造的微生物细胞，其中所述经改造的微生物细胞还包括表达反馈去调控的HMG-CoA还原酶的方式。实施方案16：实施方案9-15中任一项的经改造的微生物细胞，其中所述经改造的微生物细胞包括相对于对照细胞，由于乙酰CoA合成速率较高和/或乙酰CoA降解速率较低而提高乙酰CoA可用性的方式。实施方案17：实施方案1-16中任一项的经改造的微生物细胞，其中所述经改造的微生物细胞包括真菌细胞。实施方案18：实施方案17的经改造的微生物细胞，其中所述经改造的微生物细胞包括酵母细胞。实施方案19：实施方案18的经改造的微生物细胞，其中所述酵母细胞为酵母属(Saccharomyces)细胞。实施方案20：实施方案19的经改造的微生物细胞，其中所述酵母细胞为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)种的细胞。实施方案21：实施方案18的经改造的微生物细胞，其中所述酵母细胞为亚罗酵母属(Yarrowia)细胞。实施方案22：实施方案21的经改造的微生物细胞，其中所述酵母细胞为解脂亚罗酵母(Yarrowialipolytic本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种经改造的微生物细胞，其中所述经改造的微生物细胞表达：/n(a)非天然的香叶基二磷酸二磷酸酶(香叶醇合酶)；和/n(b)非天然的香叶醇-8羟化酶；/n其中所述经改造的微生物细胞产生(6E)-8-羟基香叶醇。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171207 US 62/596,0131.一种经改造的微生物细胞，其中所述经改造的微生物细胞表达：
(a)非天然的香叶基二磷酸二磷酸酶(香叶醇合酶)；和
(b)非天然的香叶醇-8羟化酶；
其中所述经改造的微生物细胞产生(6E)-8-羟基香叶醇。


2.权利要求1的经改造的微生物细胞，其中所述经改造的微生物细胞包含一种或多种上游(6E)-8-羟基香叶醇途径酶或上游途径活性调节因子的提高的活性，所述提高的活性为相对于对照细胞的提高。


3.权利要求2的经改造的微生物细胞，其中所述一种或多种上游(6E)-8-羟基香叶醇途径酶选自ATP-柠檬酸合酶、乙酰CoA合酶、硫解酶、羟甲基戊二酰辅酶A合酶(HMG-CoA合酶)、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶)、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶、异戊烯基二磷酸δ-异构酶和香叶基二磷酸合酶。


4.权利要求3的经改造的微生物细胞，其中所述一种或多种上游(6E)-8-羟基香叶醇途径酶包括异戊烯基二磷酸δ-异构酶。


5.权利要求1-4中任一项的经改造的微生物细胞，其中所述经改造的微生物细胞包含消耗一种或多种(6E)-8-羟基香叶醇途径前体的一种或多种酶的降低的活性，所述降低的活性为相对于对照细胞的降低。


6.权利要求5的经改造的微生物细胞，其中所述消耗一种或多种(6E)-8-羟基香叶醇途径前体的一种或多种酶包括双功能的(2E，6E)-法呢基二磷酸合酶/二甲基烯丙基反式转移酶和/或香叶基焦磷酸合酶。


7.权利要求1-6中任一项的经改造的微生物细胞，其中所述经改造的微生物细胞还表达反馈去调控的HMG-CoA还原酶。


8.权利要求1-7中任一项的经改造的微生物细胞，其中所述经改造的微生物细胞包括相对于对照细胞，提高的乙酰CoA可用性，这是由于乙酰CoA的合成速率较高和/或乙酰CoA的降解速率较低。


9.一种经改造的微生物细胞，其中所述经改造的微生物细胞包含：
(a)表达非原生的天然香叶基二磷酸二磷酸酶(香叶醇合成酶)的方式；和
(b)表达非天然的香叶醇-8-羟化酶的方式；
其中所述经改造的微生物细胞产生(6E)-8-羟基香叶醇。


10.权利要求9的经改造的微生物细胞，其中所述经改造的微生物细胞包含提高一种或多种上游(6E)-8-羟基香叶醇途径酶或上游途径活性调节因子的活性的方式。


11.权利要求10的经改造的微生物细胞，其中所述一种或多种上游(6E)-8-羟基香叶醇途径酶选自ATP-柠檬酸合酶、乙酰CoA合酶、硫解酶、羟甲基戊二酰辅酶A合酶(HMG-CoA合酶)、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶)、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶、异戊烯基二磷酸δ-异构酶和香叶基二磷酸合酶。


12.权利要求11的经改造的微生物细胞，其中所述一种或多种上游(6E)-8-羟基香叶醇途径酶包括异戊烯基二磷酸δ-异构酶。


13.权利要求9-12中任一项的经改造的微生物细胞，其中所述经改造的微生物细胞包括降低消耗一种或多种(6E)-8-羟基香叶醇途径前体的一种或多种酶的活性的方式，所述降低的活性为相对于对照细胞的降低。


14.权利要求13的经改造的微生物细胞，其中所述消耗一种或多种(6E)-8-羟基香叶醇途径前体的一种或多种酶包括双功能的(2E，6E)-法呢基二磷酸合酶/二甲基烯丙基反式转移酶和/或香叶基焦磷酸合酶。


15.权利要求9-14中任一项的经改造的微生物细胞，其中所述经改造的微生物细胞还包含表达反馈去调控的HMG-CoA还原酶的方式。


16.权利要求9-15中任一项的经改造的微生物细胞，其中所述经改造的微生物细胞包括相对于对照细胞，提高乙酰CoA的可用性的方式，这是由于乙酰CoA的合成速率较高和/或乙酰CoA的降解速率较低。


17.权利要求1-16中任一项的经改造的微生物细胞，其中所述经改造的微生物细胞包括真菌细胞。


18.权利要求17的经改造的微生物细胞，其中所述经改造的微生物细胞包括酵母细胞。


19.权利要求18的经改造的微生物细胞，其中所述酵母细胞为酵母属(Saccharomyces)的细胞。


20.权利要求19的经改造的微生物细胞，其中所述酵母细胞为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)种的细胞。


21.权利要求18的经改造的微生物细...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·特雷西韦尔，S·埃德加，S·季莫申科，A·希勒，
申请(专利权)人：齐默尔根公司，
类型：发明
国别省市：美国;US