一株耐酸酿酒酵母及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株耐酸酿酒酵母及其应用，本发明专利技术的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)MTPfo‑4，于2020年6月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020199。在本发明专利技术中，利用外源添加苹果酸作为胁迫压力，实验室定向进化筛选得到S.cerevisiae耐酸突变株MTPfo‑4，耐受最低pH为2.44，这也是目前报道的酿酒酵母耐受的最低pH。同时耐受多种有机酸的突变株MTPfo‑4，对外源苹果酸的耐受增加至86.8g/L。进一步对得到的突变株MTPfo‑4进行鉴定，该突变株性状稳定生长良好，同时可以耐受多种有机酸(乳酸、苹果酸、琥珀酸、富马酸、柠檬酸、葡萄糖酸、酒石酸)，另外对无机酸(HCl、H

【技术实现步骤摘要】
一株耐酸酿酒酵母及其应用
本专利技术涉及一株耐酸酿酒酵母及其应用，属于微生物

技术介绍
短链有机酸(Short-chainorganicacids)作为微生物的天然代谢产物，近年来已广泛用于食品，生物医药，化妆品，洗涤剂，聚合物和纺织品等行业。微生物生产短链有机酸主要包括丙酸，丙酮酸，乳酸，3-羟基丙酸，三羧酸(TCA)循环中间代谢产物α-酮戊二酸，苹果酸，琥珀酸，富马酸和柠檬酸。其中，丙酸的钙盐，钠盐和铵盐具有很强的防腐能力，可作为防腐剂用于动物饲料和人类食品中。衣康酸可制备合成纤维，合成树脂和塑料，其酯衍生物可以用于苯乙烯或聚氯乙烯增塑剂。苹果酸作为天然果汁中重要成份，味道柔和(具有较高的缓冲指数)，具特殊香味，不损害口腔与牙齿，代谢上有利于氨基酸吸收，不积累脂肪，是新一代的食品酸味剂，被生物界和营养界誉为“最理想的食品酸味剂”。柠檬酸是多功能的、无毒的，被FAO/WHO(联合国粮农组织/世界卫生组织)专家委员会认定为安全的食品添加剂，被称为第一食用酸味剂，在饮料工业与酿造酒中，不仅能赋予产品水果风味，而且还有增溶、缓冲、抗氧化等作用，使色素、香气、糖分等成分交融协调，形成调和的口味和香气，同时能增强抗微生物防腐效果。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，GRAS菌株，可以作为良好的代谢工程平台生产多种有机酸产品，例如丙酮酸、乳酸，苹果酸、琥珀酸、富马酸和衣康酸。在S.cerevisiae中，硫胺素生物合成调控基因中有两个基因tHI2和tHI3，当两个基因被破坏后突变体FMME-002ΔTHI2和FMME-002ΔTHI3都能用于丙酮酸的生产，而且，FMME-002ΔTHI2的丙酮酸盐产量较高，并且当添加0.04mM硫胺素时，丙酮酸的浓度为8.21g/L。为构建富马酸的高产菌株，研究人员通过敲除富马酸酶(Fumarase)，表达来自米曲霉的基因pyc(丙酮酸羧化酶，Pyruvatecarboxylase)，最终S.cerevisiae工程菌株的富马酸产量为5.64g/L。在合成衣康酸的改造过程中，敲除酿酒酵母的三个基因ade3，bna2和tes1，高密度发酵，最终滴度为0.168g/L。目前报道的关于S.cerevisiae生产短链有机酸的产量普遍较低，基于市场经济效益考虑很难达到工业化生产水平。环境pH值是影响细胞代谢和行为的基本信号。因此，对于工程细胞来说，设计和构建底盘细胞响应不同环境pH，拥有越来越复杂的代谢调控功能是至关重要的。在S.cerevisiae中，研究比较系统的是CCW14启动子(stress-responsiveyeastpromoters，一种应激-反应启动子)。CCW14是一种细胞壁糖蛋白，在柠檬酸(pH3.5)胁迫下可以被CWI途径激活，提高宿主细胞对酸的耐受能力。研究人员对该启动子进行了进一步压力-诱导合成(stress-induciblesyntheticpromoters)，得到一系列的合成型启动子，最终筛选得到了耐受能力强的突变体CCW14v5，该启动子的应用与天然启动子TEF1相比，提高了细胞的酸耐受能力，同时在pH3.0条件下，表达了来源于植物乳杆菌的乳酸脱氢酶基因(ldhL)来生产乳酸，由合成的pH诱导型启动子控制的ldhL菌株(乳酸滴度为2.9–7.9g/L)优于天然启动子TEF1控制的ldhL菌株(乳酸产量为0.72g/L)。工业生产过程中，基于经济效益的考虑，生产商对有机酸产量要求较高，但在宿主细胞构建过程中，随着有机酸浓度的不断积累形成了低pH环境，对宿主细胞的生长有很大程度的抑制。据报道，丙酸发酵过程中，当浓度达到10g/L时，就已经成了最大的限制因素。另外，丙酮酸，3-羟基丙酸，乳酸，苹果酸，柠檬酸等短链有机酸，在发酵过程中形成的低pH对宿主细胞生长有很强的抑制作用。目前报道的微生物生产短链有机酸主要是添加中和剂(CaCO3)来调节发酵过程的低pH，生成的产物主要以有机酸盐的形式存在，后续要先经过酸解，才能进一步的分离、纯化。一方面增加了产物分离、纯化的成本和工序，另一方面如果前期添加的中和剂，或者后续酸解所用的酸反应不完全，还会造成资源的浪费和环境的污染。由于细胞本身存在很强的抗逆性，增加了耐酸系统的构建的难度，或者已经开发的耐酸底盘细胞也只能用于一种有机酸的生产，产品谱较窄，无法应用于多种有机酸的生产。
技术实现思路
为解决上述存在的低pH抑制宿主细胞生长，添加中和剂提高成本、增加后续分离和纯化工序、容易造成环境污染等问题。本专利技术中为了得到经济有效且发酵过程不添加非中和的宿主细胞(cost-effectivenon-neutralizingfermentationhoststrains)，外源添加苹果酸作为筛选压力，对酿酒酵母进行迭代进化，解决酿酒酵母低pH条件下生长及生产短链有机酸的问题，主要专利技术目的是提高酿酒酵母耐酸能力，构建酿酒酵母耐酸底盘细胞工厂，用于生产多种短链有机酸。本专利技术的第一个目的是提供一株耐酸酿酒酵母，命名为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)MTPfo-4，于2020年6月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCM2020199。进一步地，所述的酿酒酵母耐受最低pH为2.44。进一步地，所述的酿酒酵母对外源苹果酸的耐受达到86.6g/L。本专利技术的第二个目的是提供所述的酿酒酵母在短链有机酸生产中的应用。进一步地，所述的应用是采用所述的酿酒酵母作为底盘细胞，构建生产短链有机酸的菌株。进一步地，所述的短链有机酸为丙酮酸，3-羟基丙酸、乳酸、苹果酸、琥珀酸、富马酸、柠檬酸、葡萄糖酸、酒石酸、糠酸中的一种或多种。本专利技术的第三个目的是提供一种包含所述的酿酒酵母的微生物菌剂。进一步地，所述的微生物菌剂为固体菌剂。进一步地，所述的微生物菌剂为液体菌剂。本专利技术的有益效果：在本专利技术中，利用外源添加短链有机酸苹果酸作为胁迫压力，实验室定向进化筛选得到S.cerevisiae耐酸突变株MTPfo-4，耐受最低pH为2.44，这也是目前报道的酿酒酵母耐受的最低pH。同时耐受多种有机酸的突变株MTPfo-4，对外源苹果酸的耐受增加至86.6g/L。进一步对得到的突变株MTPfo-4进行鉴定，该突变株性状稳定生长良好，同时可以耐受多种有机酸(乳酸、苹果酸、琥珀酸、富马酸、柠檬酸、葡萄糖酸、酒石酸)，另外对无机酸(HCl、H2PO3)也有很强的耐受能力，这在目前已知的S.cerevisiae研究报道中是很难达到的。以期作为耐酸底盘细胞工厂，用于多种短链有机酸的生产。生物材料保藏：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)MTPfo-4，于2020年6月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCM2020199。附图说明图1为耐酸酿酒酵母的进化与筛选；图2为酿酒酵母及本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株耐酸酿酒酵母，其特征在于，命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)MTPfo-4，于2020年6月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2020199。/n

【技术特征摘要】
1.一株耐酸酿酒酵母，其特征在于，命名为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)MTPfo-4，于2020年6月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCM2020199。


2.根据权利要求1所述的酿酒酵母，其特征在于，所述的酿酒酵母耐受最低pH为2.44。


3.根据权利要求1所述的酿酒酵母，其特征在于，所述的酿酒酵母对外源苹果酸的耐受达到86.6g/L。


4.根据权利要求1所述的酿酒酵母，其特征在于，所述的酿酒酵母可耐受乳酸、苹果酸、琥珀酸、富马酸、柠檬酸、葡萄糖酸、酒石酸、HCl、H2PO3中的一种或多种。

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，陈坚，堵国成，李江华，吕雪芹，孙利，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32