靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体制造技术

描述了编码嵌合抗原受体(CAR)和截短的人表皮生长因子受体(huEGFRt)的核酸构建体。所编码的CAR包括与CD8α铰链区、CD8α跨膜区、4‑1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域融合的肿瘤抗原特异性单克隆抗体，例如glypican‑3(GPC3)‑特异性、GPC2‑特异性或间皮素‑特异性单克隆抗体。还描述了分离的宿主细胞，例如共表达所公开的CAR和huEGFRt的分离的T细胞。用所公开的CAR构建体转导的T细胞可用于癌症免疫疗法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体相关申请的交叉引用本申请要求2017年11月10日提交的美国临时申请第62/584,421号的权益，其通过引用结合入本文。
本公开涉及对肿瘤抗原特异的嵌合抗原受体，及其用于癌症免疫疗法的用途。政府支持的致谢本专利技术在美国国家卫生研究院、国家癌症研究所(NationalInstitutesofHealth,NationalCancerInstitute)所授予的项目号Z01BC010891的政府支持下做出。美国政府对本专利技术拥有一定的权利。
技术介绍
嵌合抗原受体(CAR)由与跨膜结构域和T细胞信号传导部分融合的对肿瘤抗原特异的抗体片段组成。当所述受体在T细胞表面上表达时，其介导与靶的结合并激活T细胞，最终诱导靶细胞裂解。CAR正成为最有希望的治疗血液恶性肿瘤的方法之一(Kochenderferetal.,Blood119:2709-2720,2012；KochenderferandRosenberg,NatRevClinOncol10:267-276,2013；Porteretal.,NewEnglJMed365:725-733,2011；Maudeetal.,NewEnglJMed371:1507-1517,2014；Gruppetal.,NewEnglJMed368:1509-1518,2013)。在美国已经批准了两种CD19-靶向的CAR，即axicabtageneciloleucel(YescartaTM)和tisagenlecleucel(KymriahTM)，它们分别用于治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤和B细胞急性淋巴细胞白血病。目前正在进行临床试验，以测试用于治疗实体瘤的各种CART细胞疗法(Yuetal.,JHematolOncol10(1):78,2017)。专利技术概要本文公开了编码嵌合抗原受体(CAR)和截短的人表皮生长因子受体(huEGFRt)的核酸构建体。编码的CAR包括与细胞外铰链区、跨膜区、细胞内共刺激结构域和细胞内信号传导结构域融合的肿瘤抗原特异性单克隆抗体片段。huEGFRt包括两个EGFR胞外结构域(结构域III和结构域IV)和一个EGFR跨膜结构域，但是缺少两个膜远端胞外结构域和所有的细胞内结构域。还公开了共表达所公开的CAR和huEGFRt的分离的细胞，例如T淋巴细胞。用CAR构建体转导的T细胞可用于癌症免疫疗法。本文提供了编码CAR和huEGFRt的核酸分子。在一些实施方式中，所述核酸分子以5’至3’的方向包括编码第一信号序列的核酸；编码抗原特异性抗体或其抗原结合片段的核酸；编码细胞外铰链区的核酸；编码跨膜结构域的核酸；编码细胞内共刺激结构域的核酸；编码细胞内信号传导结构域的核酸；编码自裂解2A肽的核酸；编码第二信号序列的核酸；和编码huEGFRt的核酸。在一些实例中，第一和/或第二信号序列是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体信号序列(GMCSFRss)，细胞外铰链区是CD8α铰链区，跨膜结构域是CD8α跨膜结构域，细胞内共刺激结构域是4-1BB共刺激结构域，并且细胞内信号传导结构域是CD3ζ信号传导结构域。在一些实例中，所述抗体或抗原结合片段特异性结合肿瘤抗原，例如glypican-3(GPC3)、GPC2或间皮素。还提供了包括本文公开的核酸分子的载体，例如病毒载体。在具体的非限制性实例中，病毒载体是慢病毒载体。进一步提供了包括本文公开的核酸分子的分离的宿主细胞。还提供了共表达CAR和huEGFRt的分离的宿主细胞。在一些实施方式中，CAR包括抗原特异性抗体或其抗原结合片段、细胞外铰链区、跨膜结构域、细胞内共刺激结构域和细胞内信号传导结构域；和/或huEGFRt包括来自人EGFR的结构域III、结构域IV和跨膜结构域，但是缺少表皮生长因子(EGF)-结合结构域和细胞质结构域。在一些实例中，细胞外铰链区包括CD8α铰链区，跨膜结构域包括CD8α跨膜结构域，细胞内共刺激结构域包括4-1BB共刺激结构域，并且细胞内信号传导结构域包括CD3ζ信号传导结构域。在一些实例中，所述抗体或抗原结合片段特异性结合肿瘤抗原，例如GPC3、GPC2或间皮素。进一步提供了包括本文公开的分离的宿主细胞和药学上可接受的载体的组合物。在一些实施方式中，分离的宿主细胞是T淋巴细胞。进一步提供了在受试者中治疗GPC3-阳性癌症、GPC2-阳性癌症或间皮素-阳性癌症的方法，通过给所述受试者施用本文公开的分离的宿主细胞。在一些实施方式中，分离的宿主细胞是T淋巴细胞，例如自体T淋巴细胞。从以下参考附图进行的详细描述中，本专利技术的前述和其它目的、特征和优点将变得更加明显。附图说明图1是用于产生肿瘤-靶向嵌合抗原受体(CAR)的慢病毒构建体的示意图。该慢病毒构建体包括CAR编码区和编码截短的人表皮生长因子受体(huEGFRt)的区域，各自之前都有一个粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体信号序列(GMCSFRss)。所述两个区域被自裂解T2A序列分开，使得在该构建体表达后，CAR从huEGFRt上切割下来。该构建体的表达由人延伸因子1α(EF1α)启动子驱动。所述CAR包括抗原结合区、CD8α铰链区、CD8α跨膜(TM)结构域、4-1BB共刺激区和CD3ζ信号传导结构域。所述huEGFRt包括两个胞外结构域(结构域III和结构域IV)和一个TM结构域。图2A-2C为以下构建体的载体图谱：编码CAR.HN3的pMH288(图2A)、编码CAR.hYP7的pMH289(图2B)和编码CAR.LH7的pMH290(图2C)。图3A-3C是显示GPC3-靶向CART细胞的转导效率的流式细胞图。使用抗-huEGFRt抗体西妥昔单抗(cetuximab)测定转导效率。编码CAR.HN3(图3A)和CAR.hYP7(图3B)的慢病毒载体分别转导65％和45.4％的T细胞。(图3C)对照人血清IgG。图4A-4G是显示GPC3-靶向CART细胞对人细胞系的细胞毒性的图。使用1:2、1.5:1、5:1和16:1的效应子：靶比例，在GPC3+G1细胞(图4A)、GPC3+Hep3B细胞(图4B)、GPC3+HepG2细胞(图4C)、GPC3+Huh7细胞(图4D)、GPC3-A431细胞(图4E)、GPC3-T3M4细胞(图4F)和GPC3-IMR32细胞(图4G)上测试CAR.hYP7。CAR.hYP7对GPC3-阳性细胞系有细胞毒性，但对GPC3-阴性细胞系没有细胞毒性。图5是显示CAR.hYP7T细胞诱导靶GPC-阳性Hep3B、Huh7和G1肿瘤细胞的干扰素(IFN)-γ分泌的图。图6显示在用GPC3-靶向T细胞治疗的小鼠中Hep3B肿瘤抑制的生物发光图像。小鼠在第0天静脉内注射400万个Hep3B细胞。在第10天，对小鼠进行空白注射或注射PBS、1000万个CAR.HN3T细胞(HN3-10M)、1000万个CAR.hYP7T细胞(hYP7-10M)、2000万个CAR.hYP7T细胞(hYP7-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其以5'至3'的方向包括：/n编码第一粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体信号序列(GMCSFRss)的核酸；/n编码抗原特异性抗体或其抗原结合片段的核酸；/n编码细胞外铰链区的核酸；/n编码跨膜结构域的核酸；/n编码细胞内共刺激结构域的核酸；/n编码细胞内信号传导结构域的核酸；/n编码自裂解2A肽的核酸；/n编码第二GMCSFRss的核酸；和/n编码截短的人表皮生长因子受体(huEGFRt)的核酸。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171110 US 62/584,4211.编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其以5'至3'的方向包括：
编码第一粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体信号序列(GMCSFRss)的核酸；
编码抗原特异性抗体或其抗原结合片段的核酸；
编码细胞外铰链区的核酸；
编码跨膜结构域的核酸；
编码细胞内共刺激结构域的核酸；
编码细胞内信号传导结构域的核酸；
编码自裂解2A肽的核酸；
编码第二GMCSFRss的核酸；和
编码截短的人表皮生长因子受体(huEGFRt)的核酸。


2.权利要求1的核酸分子，其中所述细胞外铰链区包括CD8α铰链区或CD28铰链区。


3.权利要求1或权利要求2的核酸分子，其中所述跨膜结构域包括CD8α跨膜结构域或CD28跨膜结构域。


4.权利要求1-3中任一项的核酸分子，其中所述细胞内共刺激结构域包括4-1BB、CD28、ICOS、OX40、CD27或DAP10共刺激结构域。


5.权利要求1-4中任一项的核酸分子，其中所述细胞内信号传导结构域包括CD3ζ或FcεRIγ信号传导结构域。


6.权利要求1-5中任一项的核酸分子，其中所述细胞外铰链区包括CD8α铰链区，所述跨膜结构域包括CD8α跨膜结构域，所述细胞内共刺激结构域包括4-1BB共刺激结构域，并且所述细胞内信号传导结构域包括CD3ζ信号传导结构域。


7.权利要求6的核酸分子，其中编码所述CD8α铰链的核酸包括SEQIDNO:3的序列。


8.权利要求6或权利要求7的核酸分子，其中编码所述CD8α跨膜结构域的核酸包括SEQIDNO:5的序列。


9.权利要求6-8中任一项的核酸分子，其中编码所述4-1BB共刺激结构域的核酸包括SEQIDNO:7的序列。


10.权利要求6-9中任一项的核酸分子，其中编码所述CD3ζ信号传导结构域的核酸包括SEQIDNO:9的序列。


11.权利要求1-10中任一项的核酸分子，其中编码所述第一GMCSFRss的核酸和编码所述第二GMCSFRss的核酸各自包括SEQIDNO:1的序列。


12.权利要求1-11中任一项的核酸分子，其中所述自裂解2A肽是T2A肽并且编码所述自裂解2A肽的核酸包括SEQIDNO:11的序列。


13.权利要求1-12中任一项的核酸分子，其中编码所述huEGFRt的核酸包括SEQIDNO:13的序列。


14.权利要求1-13中任一项的核酸分子，进一步在编码所述第一GMCSFRss的核酸的5'包括人延伸因子1α(EF1α)启动子序列。


15.权利要求1-14中任一项的核酸分子，其中所述抗原结合片段是单链可变片段(scFv)或单域抗体。


16.权利要求1-15中任一项的核酸分子，其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合肿瘤抗原。


17.权利要求16的核酸分子，其中所述肿瘤抗原是glypican-3(GPC3)。


18.权利要求17的核酸分子，其中编码所述抗体结合片段的核酸包括SEQIDNO:25的重链可变(VH)结构域互补决定区1(CDR1)、CDR2和CDR3核酸序列和SEQIDNO:27的轻链可变(VL)结构域CDR1、CDR2和CDR3核酸序列。


19.权利要求17的核酸分子，其中编码所述抗体结合片段的核酸包括SEQIDNO:15的核苷酸73-807的序列。


20.权利要求17的核酸分子，其中编码所述抗体结合片段的核酸包括SEQIDNO:29的CDR1、CDR2和CDR3核酸序列。


21.权利要求17的核酸分子，其中编码所述抗体结合片段的核酸包括SEQIDNO:17的核苷酸73-420的序列。


22.权利要求16的核酸分子，其中所述肿瘤抗原是glypican-2(GPC2)。


23.权利要求22的核酸分子，其中编码所述抗体结合片段的核酸包括SEQIDNO:31的CDR1、CDR2和CDR3核酸序列。


24.权利要求22的核酸分子，其中编码所述抗体结合片段的核酸包括SEQIDNO:19的核苷酸73-432的序列。


25.权利要求16的核酸分子，其中所述肿瘤抗原是间皮素。


26.包含权利要求1-25中任一项的核酸分子的载体。


27.权利要求26的载体，其中所述载体是病毒载体。


28.权利要求27的载体，其中所述病毒载体是慢病毒载体。


29.分离的宿主细胞，其包括权利要求1-25中任一项的核酸分子或权利要求26-28中任一项的载体。


30.分离的宿主细胞，其共表达嵌合抗原受体(CAR)和截短的人表皮生长因子受体(huEGFRt)，其中：
所述CAR包括抗原特异性抗体或其抗原结合片段、细胞外铰链区、跨膜结构域、细胞内共刺激结构域和细胞内信号传导结构域；和
所述huEGFRt包括来自人EGFR的结构域III、结构域IV和跨膜结构域，但缺少表皮生长因子(EGF)-结合结构域和细胞质结构域。


31.权利要求30的分离的宿主细胞，其中所述细胞外铰链区包括CD8α铰链区或CD28铰链区。


32.权利要求30或权利要求31的分离的宿主细胞，其中所述跨膜结构域包括CD8α跨膜结构域或CD28跨膜结构域。


33.权利要求30-32中任一项的分离的宿主细胞，其中所述细胞内共刺激结构域包括4-1BB、CD28、ICOS、OX40、CD27或DAP10共刺激结构域。


34.权利要求30-33中任一项的分离的宿主细胞，其中所述细胞内信号传导结构域包括CD3ζ或FcεRIγ信号传导结构域。


35.权利要求30-34中任一项的分离的宿主细胞，其中所述细胞外铰链区包括CD8α铰链区，所述跨膜结构域包括CD8α跨膜结构域，所述细胞内共刺激结构域包括4-1BB共刺激结构域，并且所述细胞内信号传导结构域包括CD3ζ信号传导结构域。


36.权利要求35的分离的宿主细胞，其中所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：何苗壮，李楠，李丹，
申请(专利权)人：美国政府由卫生和人类服务部的部长所代表，
类型：发明
国别省市：美国;US