半胱氨酸工程化的抗原结合分子制造技术

一种特异性抗原结合成员(ABM)，包含特异性抗原结合部分和包含CH2结构域的抗体Fc区域，其经工程化在位置108和/或113处进行半胱氨酸取代，其中根据IMGT进行编号，并且其中抗体Fc区域不包含抗原结合CH3结构域的；以及一种ABM缀合物(ABMC)，包含ABM和在CH2结构域的位置108和113处共价缀合至半胱氨酸中的一个或两个的至少一个异源分子。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】半胱氨酸工程化的抗原结合分子
本专利技术涉及抗原结合成员(ABM)，其包含半胱氨酸工程化的抗体Fc区域，和ABM缀合物，其中一个或多个异源分子，缀合至任何半胱氨酸。
技术介绍
单克隆抗体已被广泛地用作治疗性抗原结合分子。本文将以完整的IgG1免疫球蛋白为例解释基本的抗体结构。两个同一性重链(H)和两个同一性轻链(L)结合形成Y形抗体分子。重链各具有四个结构域。氨基末端可变结构域(VH)位于Y的尖端。接着是三个恒定结构域：CH1、CH2和羧基末端CH3，位于Y的茎的基部。一小段延伸、开关，将重链可变区域和恒定区域连接起来。铰链将CH2和CH3(Fc片段)连接至抗体的残余部分(Fab片段)。通过完整抗体分子中铰链的蛋白水解切割可以产生一个Fc和两个同一性Fab片段。轻链由可变的(VL)和恒定的(CL)两个结构域构成，两个结构域由开关隔开。铰链区域中的二硫键连接两条重链。轻链通过另外的二硫键与重链偶联。取决于免疫球蛋白的种类，Asn连接的碳水化合物部分在恒定结构域的不同位置连接。对于IgG1，在Cys235和Cys238对之间的铰链区域中的两个二硫键将两条重链联合在一起。与在CL结构域中的Cys214(EU索引和Kabat编号)之间，轻链通过两个额外的二硫键与重链偶联，在CH1结构域中的Cys220(EU索引编号)或Cys233(根据Kabat进行编号)。碳水化合物部分连接到每个CH2的Asn306上，在Y的茎中产生明显的凸起。这些特征具有深远的功能性后果。重链和轻链(VH)和(VL)的可变区域都位于N-末端区域，即Y的“尖端”，它们位于其中与抗原反应的位置。分子的这个尖端是氨基酸序列N-末端所在的一侧。Y的茎以某种方式凸出有效地介导效应子功能，例如补体的激活和与Fc受体，或ADCC和ADCP相互作用。其CH2和CH3结构域凸起，以促进与效应子蛋白的相互作用。氨基酸序列的C-末端位于尖端的相对侧，其可以被称为Y的“底部”。在抗体中发现了两种类型的轻链，分别称为拉姆达(λ)和卡帕(κ)。给定的免疫球蛋白具有κ链或λ链，而不是每个仅具有一种。在具有λ或κ轻链的抗体之间未发现功能差异。抗体分子中的每个结构域都具有相似的结构两个β片层，所述两个β片层在压缩的反平行β桶中彼此紧紧堆靠。这种保守的结构称为免疫球蛋白折叠。恒定结构域的免疫球蛋白折叠包含与4-链片层堆靠的3-链折叠。通过每个片层的β链之间的氢键，通过内部相对的片层的残基之间的疏水键，以及通过片层之间的二硫键，来稳定折叠。3-链片层包含链C、F和G，而4-链片层包含链A、B、E和D。字母A到G表示β链沿着免疫球蛋白折叠的氨基酸序列的顺序位置。可变结构域的折叠具有布置成4和5链的两个片层的9个β链。5-链片层与恒定结构域的3-链片层在结构上是同源的，但是包含额外的链C'和C”。链的残余部分(A、B、C、D、E、F、G)在恒定结构域免疫球蛋白折叠中具有与它们的对应物相同的拓扑结构和相似的结构。如在恒定结构域中，二硫键连接相对片层中的链B和F。轻和重免疫球蛋白链的可变结构域均包含三个高变环，或互补决定区域(CDR)。V结构域的三个CDR(CDR1、CDR2、CDR3)在β桶的一端成簇。CDR是连接免疫球蛋白折叠的β链B-C、C'-C”和F-G的环。CDR中的残基从一个免疫球蛋白分子变化到下一个，从而为每个抗体赋予了抗原特异性。抗体分子尖端处的VL和VH结构域紧密堆积，使得6个CDR(每个结构域上的3个)协同构建表面(或空腔)，以进行抗原特异性结合。因此，抗体的天然的抗原结合位点，由环组成，所述环连接轻链可变结构域的链B-C、C'-C”和F-G，和重链可变域的链B-C、C'-C”和F-G。天然免疫球蛋白中不是CDR环的环，或不是通过CDR环和在CDR环区域内的可选相邻环所决定的抗原结合袋的一部分，没有抗原结合或表位结合特异性，但有助于校正整个免疫球蛋白分子和/或其效应子或其他功能的折叠，因此被称为结构环。因此，应通过以下方式理解根据本专利技术所述的“结构环”或“非CDR环”：免疫球蛋白由具有所谓的免疫球蛋白折叠的结构域组成。本质上，反平行的β片层通过环连接，以形成压缩的反平行的β桶。在可变区域中，结构域的一些环基本上有助于抗体的特异性，即与抗原的结合。这些环称为CDR环。抗体结构域的所有其他环，都相当地有助于分子的结构和/或效应子功能。这些环在本文中定义为结构环或非CDR环。抗原结合Fc片段(也称为FcabTM[f-star公司；具有抗原结合位点的Fc片段(Wozniak-Knoppetal.,2010)]包含例如，修饰的IgG1的Fc结构域，其以高亲和力特异性地结合抗原，在例如WO2009/132876A1和WO2009/000006A1中所描述。当前正在开发各种抗体构建体以提供抗体药物缀合物(ADC)。ADC将抗体的特异性与药物的细胞毒性结合在一起，从而提高了两者的治疗效果。ADC通常地由抗体、接头和细胞毒素组成。抗体的作用是将药物靶向递送至细胞。在特定情况下，抗原-抗体复合物的有效的内在化，对于ADC作用机制至关重要。内在化之后，接头发生裂解，毒素以其活性形式释放。在释放之前，毒素由于缀合而失活，因此在循环中稳定且无害。在ADC中，当前使用的细胞毒素可分为两类：通过抑制微管组装与微管相互作用的毒素(例如美登木素生物碱和澳瑞他汀)，以及与DNA小沟结合并通过诱导DNA链断裂导致细胞死亡的那些(例如，加利车霉素(calicheamicin))。(惠氏(Wyeth)，吉妥单抗)使用加利车霉素衍生物，并且是由美国食品药品监督管理局批准的首个ADC，用于治疗急性髓细胞性白血病。由于安全方面的考虑和对患者利益方面尚未满意，它于2010年退出市场。当前，在各种临床试验中有几个ADC。通常地，使用在循环中稳定的接头，因为细胞毒素的早期释放，否则可能导致非特异性细胞杀伤。所选的接头易于在溶酶体中裂解，并在细胞内释放药物。当前，有四种不同类型的接头：对酸不稳定的接头，其在中性pH(例如血液)下稳定，并在酸性环境中进行水解；基于二硫键的接头，其由于谷胱甘肽的高细胞内浓度，在胞质溶胶中裂解；基于肽的接头，其通过肽键将药物与抗体缀合，并由于溶酶体蛋白酶而释放；含硫醚的不可裂解的接头，其更加稳定，并被认为可通过细胞内蛋白水解降解来释放药物。可以通过部分地还原链间二硫键，或通过定点诱变引入新的表面半胱氨酸，以创建特异性的缀合位点来引入游离的硫醇(SH)-基团(Junutula,Bhakta,etal.,2008；Voynovetal.,2010)。由此具有反应性的硫醇基团的构建体，作为“前ADC”来提供。表面半胱氨酸在各个位置的工程化已在WO2013/070565A1、WO22014/124316A1、WO2015/157595A1和WO2017/112624A1中进行了描述。需要在不改变Fc片段的基本特性的情况下改进抗体的半胱氨酸工程化。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供改进的半胱氨酸工程化的AB本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.特异性抗原结合成员(ABM)，其包含特异性抗原结合部分和抗体Fc区域，所述抗体Fc区域包含CH2结构域，其经工程化在位置108和/或113处进行半胱氨酸取代，其中根据IMGT进行编号，以及其中所述抗体Fc区域不包含抗原结合CH3结构域。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171003 EP 17194497.81.特异性抗原结合成员(ABM)，其包含特异性抗原结合部分和抗体Fc区域，所述抗体Fc区域包含CH2结构域，其经工程化在位置108和/或113处进行半胱氨酸取代，其中根据IMGT进行编号，以及其中所述抗体Fc区域不包含抗原结合CH3结构域。


2.根据权利要求1所述的ABM，其中抗原结合部分与所述抗体CH2结构域的N-末端融合。


3.根据权利要求1或2所述的ABM，其中所述CH2结构域包含一个或两个半胱氨酸取代，其为N108C和/或L113C，其中根据IMGT进行编号。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的ABM，其中所述抗原结合部分包含抗体的抗原结合部分、酶、粘附蛋白、受体的配体或配体结合部分。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的ABM，其中所述抗原结合部分选自由Fab、F(ab')2、scFv、Fd、Fv、和在CDR中包含至少一个抗体结合位点的一个或多个抗体结构域组成的组。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的ABM，其中抗原结合部分通过接头和/或铰链区与所述CH2结构域的N-末端融合。


7.根据权利要求1至6中任一项所述的ABM，其中所述CH2结构域的C-末端与CH3结构域的N-末端融合，优选地，其中所述Fc区域包含于抗体Fc中，所述抗体Fc由抗体重链的二聚体组成。


8.根据权利要求1至7中任一项所述的ABM，其中所述Fc区域是IgG、IgA、IgM或IgE同种型的，优选地，是人类抗体的。


9.根据权利要求1至8中任一项所述的ABM，其选自由单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体，和抗体的抗原结合部分组成的组。


10.根据权利要求1至9中任一项所述的ABM，其特异性地识别在目标细胞表面上表达的目标抗原。


11.ABM缀合物(ABMC)，其包含权利要求1至10中任一项所述的ABM，和...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·沃兹尼亚克克诺普，F·吕克尔，G·斯塔德迈尔，J·雷布卡，N·拉舍，S·迪克吉塞尔，
申请(专利权)人：默克专利有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE