一种用于RNA恒温扩增检测布氏杆菌的引物和探针、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于RNA恒温扩增检测布氏杆菌的引物探针、试剂盒及检测方法。本发明专利技术特异性检测引物探针以及含有该检测引物探针的检测试剂盒和利用该检测试剂盒通过RNA恒温扩增的检测方法具有灵敏度高、特异性强、污染低(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)、快速的特点，对仪器要求低，操作过程简单。

【技术实现步骤摘要】
一种用于RNA恒温扩增检测布氏杆菌的引物和探针、试剂盒及检测方法
本专利技术涉及致病菌微生物检测
，具体涉及一种基于RNA恒温扩增检测布氏杆菌快速检测技术，特别涉及检测布氏杆菌的特异性检测引物探针、试剂盒及检测方法。
技术介绍
布氏杆菌是革兰氏阴性需氧杆菌。分类上为布氏杆菌属。本属细菌为非抗酸性，无芽胞，无荚膜，无鞭毛，呈球杆状。布氏杆菌首先感染家畜。家畜临床表现不明显。但怀孕的母畜则极易引起流产或死胎，所排出的羊水、胎盘、分泌物中含大量布氏杆菌，特别有传染力。而其皮毛，尿粪，奶液中均有此菌。排菌可长达三个月以上。人通过与家畜的接触，服用了污染的奶及畜肉，吸入了含菌的尘土或菌进入眼结合膜等途径，皆可遭受感染。发病年龄大多在30岁以上。同时，布氏杆菌含有内毒素及菌体本身皆可引起人体的过敏，出现各种的变态反应性病变。骨关节病变，多发生在半年左右，少数病例更早些。布氏杆菌骨髓炎是血源性布氏杆菌感染在骨关节的局部表现。任何骨均可受累，但以脊椎炎最为多见。关节的病变常侵犯大关节，以髋关节炎最为常见。因此，快速检测生活中的布氏杆菌，不仅能够及时有效地预防治疗相关疾病，减少损失，同时也是控制和消灭畜间布氏杆菌病的流行的必要手段。近年来，食源性致病菌的快速检测和鉴定方法发展较为迅速，以免疫学为基础的ELISA技术、免疫磁珠技术、全自动免疫酶标检测系列、免疫胶体金技术等，以分子生物学为基础的RNA指纹图谱技术、实时荧光PCR技术、基因芯片技术等，以纸片法为代表的细菌代谢为基础的酶触反应技术等，这些快速检测方法大大缩短了致病菌检验的时间，提高了检验效率，但也存在一些问题难以解决。国标培养法检测布氏杆菌需要4～7天，行标实时荧光PCR法需要2～5天，实时荧光核酸恒温扩增检测技术(SAT)检测布氏杆菌需要6小时，NucleicAcidSequenceBasedAmplification(NASBA)和TranscriptionMediatedAmplification(TMA)暂无相关布氏杆菌检测试剂盒。传统布氏杆菌检测方法由于菌浓度较低且培养条件要求较高，耗费时间长、检验效率低，从而导致不能及时监控布氏杆菌，不能实现现场检测。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供一种用于RNA恒温扩增检测布氏杆菌的引物探针、试剂盒及检测方法，实现对布氏杆菌的现场快速(150min内)、准确检测为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种用于RNA恒温扩增检测布氏杆菌的引物和探针，所述引物序列包括：上游引物nT7：所述上游引物nT7包含：CATCATGTTGGTGTTGAGAC，或其同源序列中的至少10个核苷酸序列；下游引物T7：所述下游引物T7包含T7启动子序列和靶标引物序列；其中所述T7启动子序列包含AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA或其同源序列中的至少10个核苷酸序列；所述靶标引物序列包含TTACATCTTCTCTTCACGAT或其同源序列中的至少10个核苷酸序列；所述探针具有环和自身互补的茎的发夹结构。根据本专利技术的某些实施方式，所述探针的两端分别共价标记有荧光基团和淬灭基团，优选所述荧光基团包含FAM、HEX或VIC，优选所述淬灭基团包含DABCYL。根据本专利技术的某些实施方式，所述探针序列包含：CGCGAUCAACAAAAGAAAGAAAUCGCG，或其同源序列中的至少10个核苷酸。根据本专利技术的某些实施方式，所述同源序列指的是与所述序列至少70％相同的核苷酸序列。根据本专利技术的某些实施方式，所述同源序列具有与本专利技术公开的序列有基本相同的活性。根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种用于RNA恒温扩增检测布氏杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括反应液，含有所述引物和探针的检测液，以及含有T7RNA聚合酶和M-MLV反转录酶的酶液。根据本专利技术的某些实施方式，所述反应液包含5～15mmol/LTrisHCl，35～45mmol/LMgCl2，0.5～5mMdNTPs，1～10mMNTPs，2.5～2.7mmol/LKCl，5～15mmol/LNa2HPO4，1.5～2.5mmol/LKH2PO4；根据本专利技术的某些实施方式，所述检测液包含2.5μM～10μM上游引物nT7，2.5μM～10μM下游引物T7，0.5～10μM荧光探针，0.5～1.5mmol/LTris-HClpH7.0～8.5，0.5～1.5mmol/LEDTA，余量为DEPC水；根据本专利技术的某些实施方式，所述酶液包含500～1000U/反应M-MLV反转录酶、500～1500U/反应T7RNA聚合酶，0.5～1.5mmol/LTris-HClpH7.0～8.5，2.5～2.7mmol/LKCl，0.5～1.5mmol/LEDTA，5％～15％BSA。根据本专利技术的某些实施方式，所述试剂盒包括：反应液：所述反应液包含5～15mmol/LTrisHCl，35～45mmol/LMgCl2，0.5～5mMdNTPs，1～10mMNTPs，2.5～2.7mmol/LKCl，5～15mmol/LNa2HPO4，1.5～2.5mmol/LKH2PO4；检测液：所述检测液包含1.0nM～6.0nM上游引物nT7，1.0nM～6.0nM下游引物T7，1.0～6.0nM荧光探针，0.5～1.5mmol/LTris-HClpH7.0～8.5，0.5～1.5mmol/LEDTA，余量为DEPC水；酶液：所述酶液包含500～1000U/反应M-MLV反转录酶、500～1500U/反应T7RNA聚合酶，0.5～1.5mmol/LTris-HClpH7.0～8.5，2.5～2.7mmol/LKCl，0.5～1.5mmol/LEDTA，5％～15％BSA。根据本专利技术的某些实施方式，所述试剂盒包括：反应液：所述反应液包含：10mmol/LTris-HCI，40mmol/LMgCl2，2.5mMdNTPs，6mMNTPs，2.7mmol/LKCl，10mmol/LNa2HPO4，2mmol/LKH2PO4；检测液：所述检测液包含4.5nM上游引物布氏杆菌nT7，1.5nM下游引物布氏杆菌T7，4.5nM荧光探针布氏杆菌Probe，1mmol/LTris～HClPH8.0，1mmol/LEDTA，余量为DEPC水；酶液：所述酶液包含750U/反应M-MLV反转录酶、1000U/反应T7RNA聚合酶，1mmol/LTris～HClpH8.0，2.7mmol/LKCl，1mmol/LEDTA，10％BSA。根据本专利技术的某些实施方式，所述试剂盒还包括：裂解液、核酸提取液、洗涤液、阳性对照和阴性对照。根据本专利技术的某些实施方式，所述裂解液包含5％～15％TritonX-100，4.5mol/L～5mol/L异硫氰酸胍，5～15mmol/LTrisHCl，pH7.0～8.5。根据本专利技术的某些实施方式，所述核酸提取液包含40本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于RNA恒温扩增检测布氏杆菌的引物和探针，其特征在于，/n所述引物序列包括：/n上游引物nT7：所述上游引物nT7包含：CATCATGTTGGTGTTGAGAC，或其同源序列中的至少10个核苷酸序列；/n下游引物T7：所述下游引物T7包含T7启动子序列和靶标引物序列；其中所述T7启动子序列包含AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA或其同源序列中的至少10个核苷酸序列；所述靶标引物序列包含TTACATCTTCTCTTCACGAT或其同源序列中的至少10个核苷酸序列；/n所述探针具有环和自身互补的茎的发夹结构。/n

【技术特征摘要】
20200603 CN 20201049571921.一种用于RNA恒温扩增检测布氏杆菌的引物和探针，其特征在于，
所述引物序列包括：
上游引物nT7：所述上游引物nT7包含：CATCATGTTGGTGTTGAGAC，或其同源序列中的至少10个核苷酸序列；
下游引物T7：所述下游引物T7包含T7启动子序列和靶标引物序列；其中所述T7启动子序列包含AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA或其同源序列中的至少10个核苷酸序列；所述靶标引物序列包含TTACATCTTCTCTTCACGAT或其同源序列中的至少10个核苷酸序列；
所述探针具有环和自身互补的茎的发夹结构。


2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述探针的两端分别共价标记有荧光基团和淬灭基团，优选所述荧光基团包含FAM、HEX或VIC，优选所述淬灭基团包含DABCYL。


3.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述探针序列包含：CGCGAUCAACAAAAGAAAGAAAUCGCG，或其同源序列中的至少10个核苷酸。


4.根据权利要求1或3所述的引物和探针，其特征在于，所述同源序列指的是与所述序列至少70％相同的核苷酸序列，优选所述同源序列具有与本发明公开的序列有基本相同的活性。


5.一种用于RNA恒温扩增检测布氏杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括反应液，含有权利要求1-4中任一项所述引物和探针的检测液，以及含有T7RNA聚合酶和M-MLV反转录酶的酶液。


6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
反应液：所述反应液包含5～15mmol/LTrisHCl，35～45mmol/LMgCl2，0.5～5mMdNTPs，1～10mMNTPs，2.5～2.7mmol/LKCl，5～15mmol/LNa2HPO4，1.5～2.5mmol/LKH2PO4；
检测液：所述检测液包含1.0nM～6.0nM上游引物nT7，1.0nM～6.0nM下游引物T7，1.0nM～6.0nM荧光探针，0.5～1.5mmol/LTris-HClpH7.0～8.5，0.5～1.5mmol/LEDTA，余量为DEPC水；
酶液：所述酶液包含500～1000U/反应M-MLV反转录酶、500～1500U/反应T7RNA聚合酶，0.5～1.5mmol/LTris-HClpH7.0～8.5，2.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘喜富，乌日琴，郑思晴，
申请(专利权)人：张家口富熙生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河北;13